伊枯草菌素A高产菌株的选育及其发酵工艺研究

论文摘要

伊枯草菌素A （Iturin A）是芽胞杆菌合成的一种脂肽类抗生素,是由Asn-Tyr-Asn-Gln-Pro-Asn-Ser七个氨基酸残基组成的肽链和一个β-氨基脂肪酸侧链（链长C14-C17不等）构成。IturinA对多种植物病原真菌和某些细菌的生长具有良好的抑制效果,应用于植物病害防治前景广阔。本研究筛选到一株能合成Iturin A的枯草芽胞杆菌,进而对其进行诱变育种和Iturin A发酵工艺的优化,提高了IturinA的产量,同时研究了其通过固体发酵方式,联产Iturin A和聚-丫-谷氨酸（γ-PGA）开发一种多功能生物有机肥。以西瓜枯萎病原菌为指示菌,从武汉郊区土壤中筛选到一株能有效抑制西瓜枯萎病原菌生长的菌株3-10。经过形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。研究了B. subtilis 3-10发酵液中的抑菌物质的理化性质,经LC-MS鉴定,该抑菌物质被鉴定为伊枯草菌素A （Iturin A）盆栽应用评价结果显示,B. subtilis 3-10对多种植物病原真菌的生长有较好的抑制效果,同时可以显著促进植物生长。以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为指示菌,建立了基于微孔板的高通量筛选方法,实现了Iturin A高产突变株的高通量快速筛选。以B. subtilis 3-10为出发菌株,经过紫外、硫酸二乙酯和亚硝基胍等物理化学诱变,在含有Cu2+、硫脲和IturinA粗制品等筛选因子的抗性平板上,挑选突变菌株,进而通过96-U型微孔板进行高通量初筛和发酵后HPLC复筛,筛选到1株Iturin A相对产量提高26.8%的突变株UDI-2,五代之内突变菌株的遗传稳定性尚好。以B. subtilis 3-10为研究对象,优化了Iturin A的发酵培养基和发酵条件,得到了优化的摇瓶发酵工艺。摇瓶发酵培养基为（g/L）：葡萄糖20,豆粕90,K2HPO4·3H2O 0.5, MgSO4·7H2O0.5, MnSO4·H2O 0.005;摇瓶发酵条件为：发酵温度为28℃,初始pH为7.0～7.5,种龄为10～12 h,接种量（v/v）为2%,装液量为30 mL/250 mL三角瓶。在优化的摇瓶发酵工艺条件下,B. subtilis 3-10的生物量达到1.24×1010CFU/mL, Iturin A的产量较出发培养基提高了7.48倍,达到6.10 g/L。3 L发酵罐中验证优化的发酵工艺,B. subtilis 3-10的生物量达到1.51×1010 CFU/mL, Iturin A的产量达到6.53 g/L。摇瓶上考察了Iturin A补料分批发酵,结果显示,初始葡萄糖浓度为20 g/L,待发酵过程葡萄糖浓度降至5g/L以下时,补加葡萄糖至10～20 g/L,Iturin A的产量较未补糖的对照组提高了12.4%。研究发现,当Iturin A的发酵培养基中添加谷氨酸钠时,B. subtilis 3-10合成IturinA的同时合成了聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）。本研究利用B. subtilis 3-10以菜籽饼为主要基质,通过固体发酵方式联产Iturin A和γ-PGA, Iturin A的产量达到8.65 g/kg基质（湿重）,γ-PGA的产量达到53.7g/kg基质（湿重）,B.subtilis 3-10的生物量达到8.67×109CFU/g基质（湿重）。通过固体发酵菜籽饼联产Iturin A和γ-PGA,开发出一种多功能生物有机肥,实现了防病促生双重效果,提高了菜籽饼作为有机肥的附加值和利用效率。同时,可以减少化学肥料和化学农药的使用,保护环境,实现绿色农业的持续稳定发展。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 植物病害的防治
• 1.2 枯草芽胞杆菌的生防应用现状及其主要生防机制
• 1.2.1 枯草芽胞杆菌的生防应用现状
• 1.2.2 枯草芽胞杆菌的主要生防机制
• 1.3 芽胞杆菌脂肽类抗生素
• 1.3.1 芽胞杆菌脂肽类抗生素的产生菌株
• 1.3.2 芽胞杆菌脂肽类抗生素的结构和性质
• 1.3.3 枯草芽胞杆菌合成脂肽类抗生素的机制
• 1.4 菌种选育
• 1.5 芽胞杆菌脂肽类抗生素的发酵生产
• 1.5.1 营养成分对发酵的影响
• 1.5.2 发酵条件对发酵的影响
• 1.6 本课题的研究目的和意义
• 第二章 产伊枯草菌素A枯草芽胞杆菌的选育
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 样品
• 2.2.2 菌种
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 野生菌株的筛选
• 2.2.6 LC-MS鉴定抑菌物质
• 2.2.7 Iturin A产量的检测
• 2.2.8 菌株生理生化鉴定
• 2.2.9 16S rRNA基因序列分析
• 2.2.10 盆栽应用评价
• 2.2.11 诱变育种
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 野生菌株筛选
• 2.3.2 抑菌物质的LC-MS鉴定
• 2.3.3 菌株3-10的生理生化特点
• 2.3.4 系统发育分析
• 2.3.5 盆栽应用评价
• 2.3.6 抗性筛选因子的选择
• 2.3.7 微孔板高通量筛选方法的建立
• 2.3.8 化诱变剂的剂量
• 2.3.9 初筛结果
• 2.3.10 复筛结果
• 2.3.11 高产突变株的稳定性
• 2.4 结论
• 第三章 B.subtilis 3-10高产Iturin A的发酵工艺优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 培养条件
• 3.2.5 生物量的检测
• 3.2.6 Iturin A产量的检测
• 3.2.7 发酵培养基的优化
• 3.2.8 发酵条件的优化
• 3.2.9 B.subtilis 3-10的分批发酵过程
• 3.2.10 B.subtilis 3-10的补料分批发酵
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Iturin A发酵培养基的优化
• 3.3.2 Iturin A发酵条件的优化
• 3.3.3 B.subtilis 3-10分批发酵过程
• 3.3.4 B.subtilis 3-10的补料分批发酵
• 3.3.5 B.subtilis 3-10在3L发酵罐中的分批发酵
• 3.4 结论
• 第四章 B.subtilis 3-10固体发酵联产Iturin A和γ-PGA的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 固体基质
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 主要仪器
• 4.2.5 培养条件
• 4.2.6 生物量的检测
• 4.2.7 Iturin A产量的检测
• 4.2.8 γ-PGA产量的检测
• 4.2.9 固体发酵物的应用评价
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 B.subtilis 3-10利用菜籽饼固体发酵联产Iturin A和γ-PGA
• 4.3.2 固体发酵物对西瓜苗的促生长效果
• 4.3.3 固体发酵物对西瓜枯萎病的防治效果
• 4.4 结论
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• A. Iturin A的定量方法
• B. 硕士在读期间科研成果
• C. 补充数据图片
• 致谢