腺病毒Ad.rms靶向治疗胰腺癌的研究

论文摘要

胰腺癌是世界人口死亡的恶性肿瘤之一,属消化道癌症中最难确诊的一种恶性肿瘤。尽管对胰腺癌采用传统疗法如手术、放疗、化疗等进行治疗,然而5年的生存率仍不到5%。因此,人们希望开展一种新的有效治疗策略,科学家们把目光投向了基因治疗。 现已证明胰腺癌的发生和发展与一系列基因突变有关,包括癌基因活化、抑癌基因功能丧失及细胞表面受体缺失等,因此对胰腺癌特征的了解有助于开展有效的治疗手段。综合文献资料表明,85%胰腺癌K-rasva112基因突变,生长抑素受体亚型中的SSTR2基因表达明显减少,从而导致其配体生长抑素SST对细胞生长负调控作用的丧失,进而无法抑制肿瘤细胞的生长和增殖。我们的研究则以这两个基因作为治疗对象。另一方面,选择一个合适的基因转移载体也是治疗的关键所在,在肿瘤的基因治疗中,利用重组的腺病毒载体将目的基因导入患者体内取得了较好的治疗效果。但是,如何构建一个重组腺病毒使目的基因仅在肿瘤细胞中表达成为一大难题,这也限制了临床上肿瘤治疗的应用。为了解决这一问题,本研究采用MUC1启动子。许多研究发现胰腺发生癌变时,MUC1

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 胰腺癌的流行病学
• 1.2 胰腺癌的生物学研究
• 1.3 肿瘤的基因治疗
• 1.3.1 基因治疗的途径
• 1.3.2 基因治疗载体
• 1.4 本研究的治疗策略
• 1.5 RNA干涉（RNAi）
• 1.5.1 RNAi现象的发现和发展
• 1.5.2 RNAi的作用特点
• 1.5.3 RNAi的作用机制
• 1.5.4 RNAi的应用
• 1.6 MUC1启动子与胰腺癌的靶向治疗
• 1.6.1 MUC1及其启动子的特点
• 1.6.2 MUC1基因表达的调控
• 1.6.3 MUC1的生物学功能
• 1.6.4 MUC1在肿瘤治疗中的应用
• 1.7 生长抑素和生长抑素受体
• 1.7.1 概述
• 1.7.2 生长抑素对肿瘤的抑制作用机制
• 1.8 结论
• 第二章 AdMuC1-hSSTR2选择性抑制Panc-1细胞生长的初步实验
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 质粒、菌株、酶、试剂（盒）
• 2.2.2 细胞、培养基、血清、脂质体和抗体
• 2.2.3 质粒DNA的制备
• 2.2.4 胰腺癌细胞基因组的提取
• 2.2.5 “巢式”PCR（nest PCR）扩增MUC1启动子
• 2.2.6 PCR扩增目的基因
• 2.2.7 DNA测序
• 2.2.8 从琼脂糖凝胶中回收DNA
• 2.2.9 酶切与连接
• 2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
• 2.2.11 重组质粒的构建
• 2.2.12 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.13 哺乳动物细胞培养、冻存和复苏
• 2.2.14 同源重组法构建重组腺病毒
• 2.2.15 病毒的大量制备、纯化和滴度测定
• 2.2.16 质粒DNA对细胞的转染
• 2.2.17 RT-PCR
• 2.2.18 western blot
• 2.2.19 荧光显微镜观察（Hoechst 33258染色）
• 2.2.20 细胞增殖实验（血球细胞计数）
• 2.2.21 统计学分析
• 2.3 研究结果
• 2.3.1 nest PCR法扩增得到MUC1启动子序列及测序结果
• 2.3.2 启动子MUC1、CMV的特异性和活性检测
• 2.3.3 RT-PCR分析重组病毒中hSSTR2基因在mRNA水平的表达
• 2.3.4 重组病毒中外源基因hSSTR2蛋白表达检测
• 2.3.5 AdMUC1-hSSTR2病毒对Panc-1细胞的凋亡检测
• 2.3.6 重组病毒抑制Panc-1细胞增殖分析
• 2.3.7 AdMUC1-hSSTR2病毒抑制细胞增殖的机制
• 2.4 讨论
• val12引起Panc-1细胞恶性表型的逆转'>第三章 AdH1-K-ras^val12引起Panc-1细胞恶性表型的逆转
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 质粒、酶和试剂（盒）
• 3.2.2 细胞、培养基、血清、抗体和探针
• 3.2.3 重组质粒的构建
• 3.2.4 同源重组法构建重组腺病毒
• 3.2.5 western blot
• 3.2.6 northern blot
• 3.2.7 流式细胞术检测凋亡细胞数
• 3.2.8 细胞增殖实验（软琼脂培养法）
• 3.2.9 统计学分析
• 3.3 研究结果
• val12、AdH1-empty和AdH1-p53的构建'>3.3.1 重组腺病毒AdH1-K-ras^val12、AdH1-empty和AdH1-p53的构建
• val12的分子水平效应'>3.3.2 腺病毒AdH1-K-ras^val12的分子水平效应
• val12的细胞水平效应'>3.3.3 腺病毒AdH1-K-ras^val12的细胞水平效应
• val12病毒的特异性检测'>3.3.4 AdH1-K-ras^val12病毒的特异性检测
• 3.4 讨论
• 第四章 腺病毒Ad.rms对胰腺癌的靶向性双基因治疗
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 质粒、酶和试剂
• 4.2.2 细胞、培养基、血清、抗体和动物
• 4.2.3 重组质粒的构建
• 4.2.4 western blot
• 4.2.5 细胞存活率实验
• 4.2.6 细胞增殖实验（软琼脂培养法）
• 4.2.7 流式细胞仪检测亚二倍体细胞
• 4.2.8 动物实验
• 4.2.9 组织切片凋亡分析—DNA原位末端标记法（TUNEL）
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 Ad.rms的表达盒结构图
• val12和hSSTR2的蛋白表达'>4.3.2 Western blot检测K-ras^val12和hSSTR2的蛋白表达
• 4.3.3 Ad.rms抑制Panc-1细胞增殖效应
• 4.3.4 Ad.rms感染Panc-1细胞后的DNA含量测定分析
• 4.3.5 Panc-1细胞感染Ad.rms后存活率检测
• 4.3.6 荷人瘤Panc-1裸鼠模型的建立
• 4.3.7 Ad.rms在动物水平上的抗肿瘤效应
• 4.4 讨论
• 参考文献
• 硕士期间发表和待发表的文章
• 致谢