论文摘要
目的：在本实验室已构建质粒pHi2-spIL15-CMV-TAT（L3）基础上,利用基因工程技术通过修饰细胞因子的信号肽,构建能够表达AFP抗原肽（AFP158-166）,同时表达IL-15的质粒载体。方法：①设计含AFP抗原肽基因的质粒载体：确定AFP抗原肽及相关序列,运用SignalP3.0服务器预测抗原肽在IL-2信号肽替代位点。②运用分子克隆技术构建过渡质粒pUC19-spIL-15,运用定点突变置换技术将AFP抗原肽相关序列插入IL-2SP替代位点,后将含AFP158-166序列spIL-15部分克隆入L3,并测序鉴定。③阳离子脂质体介导法质粒体外转染结肠癌细胞系SW480细胞和乳腺癌细胞系MCF-7细胞,倒置荧光显微镜评估细胞转染情况,流式细胞术分析转染效率,酶联免疫吸附方法检测IL-15的表达水平。结果：①AFP表达质粒pHi2-afpIL15-CMV-TAT（LA-15）经限制性双酶切和测序分析,结果表明质粒均已成功构建。②AFP表达质粒pHi2-afpIL15-CMV-TAT（LA-15）、L3和L6均可转染结肠癌SW480细胞和乳腺癌MCF-7细胞,转染效率为35.30%。③ELISA检测结果：LA-15及L3转染SW480细胞后24hr和48hr上清液中IL-15的表达水平有显著性差异（P<0.05）, LA-15的IL-15表达水平是L3的1.58/3.54（24hr/48hr）倍。转染MCF-7细胞后24hr和48hr上清液中IL-15的表达LA-15和L3之间有显著性差异（P<0.05）, LA-15的IL-15表达水平是L3的1.26/2.20倍。结论：①在基因克隆技术中,DNA片段克隆入质粒载体,最为关键的是酶切位点的选择,若两者有适宜的双酶切位点,则双酶切、定向克隆技术是建立基因表达载体的最佳选择；若无合适的双酶切位点,定点突变技术则是一种简便、快速、有效的方法。②所构建之质粒均能转染肿瘤细胞,并表达目的基因产物IL-15。③AFP修饰IL-15信号肽在不影响IL-15表达前提下,同时表达AFP抗原,可望用于AFP+表达肝癌免疫治疗。
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