论文摘要
目的:肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae,MP）是一种常见的呼吸道感染病原,快速诊断困难。目前临床常用的检查手段为ELISA、被动凝胶颗粒检测抗体、PCR检测抗原等,但均不理想。近年来国内专家研发了一种MP快速鉴定培养基,本研究对这种快速鉴定培养方法进行了应用评估,同时对2009年全年收住北京军区总医院呼吸内科的住院患者进行了MP感染情况的流行病学调查。流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,具有传染性强,蔓延快及波及面广的特点。2009年甲型H1N1流感病毒变异株给人们的生活、生产带了严重影响,发热门诊的流感样病例患者激增,为了快速筛查流感患者,我们对就诊的流感样病例患者进行了胶体金免疫层析检测（gold imunochrochromatographic assay, GICA）法的流感快速检测,为了更好的了解流感患者的临床特征,我们对进行GICA法快速筛查患者的基本资料、临床症状等进行了总结分析。同时,克隆和表达了甲型流感病毒的M1蛋白,为下一步改进GICA法检测流感病毒的敏感性和特异性进行了初步探索性的研究。方法:1.2008年12月1日到2009年3月1日收住北京军区总医院呼吸科的患者,共132例,（男64例,女68例）。采集患者入院后次日晨咽拭子即刻放入快速鉴定培养基进行MP培养,同时抽取静脉血,离心取血清,应用被动凝集检测试剂盒检测患者血清MP抗体。最后收集培养后咽拭子快速培养基进行MP基因片段PCR扩增,并行常规细菌、真菌培养鉴定。2.2009年1月到2009年12月收住北京军区总院呼吸科的各种急性呼吸道疾病患者500例（男300例,女200例）,采集患者入院后次日晨静脉血,分离血清,应用被动凝集检测试剂盒检测患者血清MP抗体,同时结合患者的临床资料,分析MP感染人群、季节及各疾病种类的感染情况。3.从2009年5月到2010年1月北京军区总医院发热门诊共接诊成人患者约8000余例,其中对7804例流感样症状患者进行了GICA法甲流快速检测。本研究对其临床资料进行了总结、整理、分析。4.从NCBI中查找甲流病毒的M1基因,并设计引物,提取H5N1的病毒RNA,反转录后,扩增全长,并连接到PET32a原核表达载体中,转化入大肠杆菌BL21（DE23）,应用适当的条件对其进行诱导表达,并对诱导表达的融合蛋白进行western blot验证。结果:1.132例患者咽拭子MP快速培养,41例结果阳性。对快速培养MP后的培养基进行MP基因片段的普通PCR扩增检测,结果显示:41个MP培养阳性的培养基,仅有1个培养基中MP基因PCR扩增阳性。培养结果阴性的培养基,MP基因扩增全部为阴性。故两种方法阳性符合率仅为2.5%,阴性符合率为100%。对MP快速培养后的50个培养基进行了MP基因片段real-time PCR扩增,（其中包括25个MP培养阳性,25个培养阴性的培养基）,结果仅有6个MP培养阳性的培养基PCR扩增MP基因片段为阳性,且含量极低,两种方法相比,阳性符合率为24%,阴性符合率100%。两种方法的一致性检验kappa值仅为0.24,即MP快速鉴定培养法与PCR检测方法一致性不高。快速培养MP阳性的培养基,经纯化培养、鉴定均未发现有细菌菌落,但存在至少两种真菌生长。MP快速培养法与MP抗体被动颗粒凝集检测法相比,两种检测方法kappa值仅为0.34,一致性不高。2.以MP抗体滴度≥1:80作为患者感染MP的标准,2009年1月至2009年12月,共检测500例患者,其中176例患者检测MP阳性,感染率为35.2%。第一季度和第四季度的MP感染率较其它季度稍高,但各季度、各月份之间差异无显著性意义。将500例患者分为4个年龄阶段,对各年龄段MP感染率进行分析,小于40岁年龄组MP感染率明显高于其它三组患者,大于80岁年龄组的MP感染率明显低于其它三组,差异有显著性意义。40至60岁和60至80岁组患者的MP感染率差异无显著性意义。以抗体滴度≥1:160作为患者MP近期急性感染的指标,则检测的500例患者中有105例为近期感染。近期感染组的年龄与其他抗体滴度组相比,年龄相对较小,差异有显著性意义。MP近期感染患者中,约29.5%为慢性肺部疾病加重（包括慢性支气管炎、哮喘、支气管扩张、间质性肺疾病）,36.2%为肺炎,14.3%为支气管炎。3.2009年5月到2010年1月在甲流大流行期间,应用GICA法对北京军区总医院发热门诊7804例流感样症状患者进行了流感筛查,其中202例患者GICA法检测流感阳性,占检测人群的2.59%。其中检出甲型流感患者171例,乙型流感患者24例,甲、乙流感混合感染患者7例。流感的高发季节主要为夏季和秋季,感染人群多为青壮年,主要临床症状为发热、咽痛、鼻塞、打喷嚏、流鼻涕、关节酸痛。4.成功构建了PET32a/M1原核表达质粒,并用western blot对融合蛋白的表达进行了验证。结论:1.MP快速鉴定培养基的配方在抗真菌方面还有待进一步改进,否则会对结果造成影响。2.呼吸内科住院患者全年均有MP感染,第一季度和第四季度感染率稍高,但各季度MP感染率差异无显著意义;MP感染人群主要为青壮年,多为肺炎和支气管炎。在慢性肺部疾病的患者中,MP感染可能是引起患者病情急性加重住院的因素之一。3.从2009年5月到2010年1月,流感病毒感染主要在夏季和秋季,临床表现为发热、咽痛、鼻塞、流涕,但仅根据临床症状无法判断是否为流感病毒感染。GICA法快速检测流感病毒抗原操作简便,快捷,在流感流行时可用于大量流感样病例筛查。4.成功构建了甲流病毒M1蛋白的原核表达系统,为利用M1蛋白抗体建立甲流的GICA诊断方法,进一步提高其敏感性和特异性进行了探索性研究。