论文摘要
食管癌是中国最常见恶性肿瘤之一,而河北省磁县更是我国食管癌高发地区之一。据调查,在我国食管癌高发区食管癌具有明显阳性家族史和家族聚集性,家族史阳性者可高达60%。在我们的前期流行病调查中,70%的磁县食管癌患者具有明确癌性家族史。虽然近10年来人们寻找食管癌相关基因方面作了大量工作,但至今未发现与食管癌密切相关的癌基因或抑癌基因。消减抑制杂交方法（suppression subtractive hybridization, SSH）,是1996年Diatchenk等发明的一种差异基因克隆技术,假阳性率低,特异性高,可有效克隆到低丰度差异表达基因,被广泛应用于肿瘤研究。本研究采用SSH方法,在手术切除的10例有明确癌性家族的食管癌标本中,选取食管癌组织及其配对正常食管粘膜组织,分离食管癌差异表达片段,将该差异表达片段克隆至T载体,经蓝-白斑筛选后,再用PCR方法筛选出阳性重组质粒,构建河北省磁县食管鳞癌消减cDNA文库。另外,我们还分析鉴定了部分差异表达基因,选出与食管癌相关的肿瘤基因8个,并用原位杂交方法对其中一个肿瘤相关基因ZNF14在食管癌组织及其配对食管正常粘膜表达情况进行分析研究,探讨了ZNF14表达与食管癌临床病理学特征的关系。第一部分食管癌患者差异基因cDNA文库的建立及ZNF14基因的筛选目的:建立我国食管癌（esophageal cancer）高发区河北省磁县具有癌性家族特点的食管癌组织与食管癌旁正常组织差异表达的cDNA消减文库,进而为筛选特异表达的食管癌差异基因,为探讨是否有家族性食管癌遗传基因存在,或是否存在与食管癌明确相关的突变基因位点,及该基因位点的变化是否与食管癌的发生相关的研究提供前期基础。材料与方法:实验构建cDNA消减文库的食管癌组织及癌旁正常食管粘膜组织标本取自河北省磁县具有不同癌性家族的食管癌患者10例,其中男性患者6例,女性患者4例,患者的父辈或母辈都或具有食管癌、肝癌等明确癌性病史。所有标本均为手术后新鲜标本,于液氮中保存,备用建库。术后病理诊断由磁县医院病理科和河北省人民医院病理科共同诊断证实为不同阶段的食管鳞状细胞癌。应用抑制性消减杂交技术SSH方法对10对具有癌性家族的食管癌患者的食管癌组织及癌旁正常食管粘膜组织进行差异基因的消减、克隆、测序、鉴定。标本经RNA提取后反转录为cDNA,应用抑制性消减杂交技术进行消减杂交反应,产物经巢式PCR扩增后得到差异表达的cDNA消减文库,并对扩增后的产物进行克隆,同时对cDNA克隆进行测序及基因同源性分析,从中选出与肿瘤发生密切相关的基因。结果:应用抑制性消减杂交技术进行消减杂交反应,分离出食管癌差异表达片段cDNA消减文库;并进一步对初步筛选出20个食管癌中差异表达的基因进行测序和同源性分析。分析结果与肿瘤发生、发展密切相关的基因有8个,分别为:ZNF14（锌指蛋白14）、DSC3（桥粒糖蛋白）、EEF1A1（转录延长因子）、ZNF 66（锌指蛋白66）、TLR10 （Toll样受体）、CYP4F8 （细胞色素P450酶）、SLC31A1（次级淋巴趋化因子）、FMNL（formin-like） gene、MTMR6（肌小管相关蛋白）。染色体开放片断4个:C6orf208、C14orf153、C1orf96、C20orf177。结论:应用SSH技术成功建立食管癌差异表达片段cDNA消减文库。我们应用此方法筛选出与食管癌相关的肿瘤基因8个,拟对ZNF14进行初步的研究。第二部ZNF14在食管癌组织中表达的临床意义目的:检测ZNF14在食管癌旁正常组织与食管癌组织中的表达情况,探讨ZNF14在食管鳞状细胞癌组织中表达的临床意义,并分析ZNF14表达与食管癌临床病理学特征的关系。材料与方法:河北省人民医院胸外科选取2005年～2006年食管癌患者食管癌手术后标本34例,各例标本均有明确的病理诊断及分期。用原位杂交方法（in situ hybridization, ISH）对食管癌组织及食管正常粘膜ZNF14表达情况进行分析研究,根据原位杂交染色结果分析阳性细胞染色计数情况,利用统计学软件（SPSS10.0）对数据进行χ2检验或秩和检验分析食管癌标本及癌旁组织标本原位杂交阳性结果,以P<0.05为在统计学上有明显差异。结果:ZNF14在34例食管癌患者癌组织中有32例不同程度表达,阳性率为94.1%,在正常粘膜组织中ZNF14表达4例,阳性率为11.8%。二者比较,统计学差异明显（ P<0.05）。ZNF14表达的强度与食管癌的分化、肿瘤的转移明显相关（P<0.05）,与肿瘤大小、浸润深度等无明显相关。结论:ZNF14在食管癌组织中特异表达,其表达与食管癌的发生及分化、转移明显相关,可能在食管鳞状上皮细胞的癌变过程中起一定作用,该结果进一步验证了第一部分中cDNA文库的准确性。