阿托伐他汀提高猪骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死疗效及机制的研究

论文摘要

目的：骨髓间允质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs）是急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）干细胞移植治疗的理想供体之一,但心梗扣局部恶劣的微环境不利于移植细胞的存活,导致其疗效受限。前期研究已证实他汀类药物可通过改良心肌微环境,提高干细胞移植疗效,但具体机制不清。单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）途径是调控细胞能量代谢的关键信号通路,在缺血心肌中发挥重要作用；而内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）也参与心肌缺血后微环境的调控。因此本课题通过模拟体内缺血缺氧环境,建立缺氧无血清（Hypoxia/Serum-free, H/SF）培养模型,旨在观察阿托伐他汀（Atorvastatin, Ator）对体外培养的猪骨髓间允质干细胞的影响,并研究其是否通过AMPK/eNOS通路发挥作用。方法：分离并培养猪BM-MSCs,将第三代细胞随机分为正常对照组（Nor）、缺氧/无血清对照组（H/SF）、不同浓度梯度阿托伐他汀组（Ator 0.001μM-10μM）、AMPK通路抑制剂Compound C组10μM, CC)。流式细胞仪检测各组BM-MSCs凋亡比例;蛋白免疫印迹法（western bolt, WB）检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2水平及AMPK、eNOS及其磷酸化蛋白的水平,实时定量聚合酶链反应（real time-PCR）检测AMPK和eNOS的基因表达水平。结果：阿托伐他汀（0.001μM-10μM）可以抑制缺氧/无血清条件诱导的猪骨髓间充质干细胞凋亡（P<0.05）,这种效应可以被AMPK通路阻断剂Compound C抑制（P<0.001）。蛋白免疫印迹法检测显示阿托伐他汀干组凋亡蛋白bax表达降低,同时抗凋亡蛋白bcl-2表达增加。阿托伐他汀治疗组AMPK和内皮型一氧化氮合酶基因表达增加,AMPK和内皮型一氧化氮合酶的磷酸化水平提高,且二者间存在正相关性（R=0.599,P=0.004）,这种作用同样可被Compound C抑制。结论：阿托伐他汀可以抑制缺血／无血清诱导的猪骨髓间充质干细胞凋亡,这种保护机制主要与AMPK通路介导的eNOS活化有关。目的：骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs）是急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）干细胞移植治疗的理想供体之,但心梗后局部恶劣的微环境不利于移植细胞的存活,致其疗效受限。我们的前期研究已证实他汀类药物可通过改良心肌微环境,提高干细胞移植疗效,但具体机制不清。因此,本实验通过建立猪心梗模型,移植自体骨髓间充质干细胞,观察阿托伐他汀对干细胞移植疗效的影响,并分析相关机制和信号通路。方法：42头中华小型猪（25±5kg）随机分为6组：假手术组（sham组,n=7）,对照组（AMI组,n=7）,阿托伐他汀组（Ator组,n=7）,干细胞移植组（MSCs组,n=7）,联合治疗组（Com组,n＝7）和左旋硝基精氨酸组（L-NNA组,n=7）。MSCs、Com及L-NNA组在手术前3天开始给予阿托伐他汀10mg/天,至实验终点。L-NNA组从手术当天起给予L-NNA 150mg/天,至实验终点。通过开胸结扎前降支第一与第二对角支之间的冠脉,模拟AMI；90分钟后松开结扎线；再灌注30分钟后,MSCs、Com和L-NNA组通过心肌内注射,植白体BM-MSCs 500μL（2×107细胞）。术后一周检测基线心功能及血清学标志物。术后4周为实验终点,检测心功能、血清学标志物,及分析相关信号通路蛋白。结果：通过正电子发射断层扫描技术（positron emission topography, PET）检测发现,和对照组相比,Com组心梗面积比例减小6%（95%置信区间为2.35-9.65%,P=0.002）。通过磁共振影像技术（magnetic resonance imaging, MRI）检测显示,Com组左室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）比对照组上升13.54%（95%置信区间为9.30-17.78%,P<0.001）,并且左室每搏排血量（ventricular stroke volume, LVSV）增加8.88mL/次（95%置信区间为5.88-11.87mL/次,P<0.001）。和对照组比,MSCs组心梗面积比例减小5.33%（95%置信区间为1.87-8.80%,P=0.004）,LVEF增加5.49%（95%置信区间为1.25-9.73%,P=0.013）。但是与AMI组相比,单纯他汀类药物治疗组的梗死面积和LVEF都没有显著改变（P>0.05）。组织化学分析方法显示,Ator可以增加梗死周边心肌组织的NO和NOS活性。WB分析显示,阿托伐他汀可增加AMPK和eNOS的磷酸化水平,并且这一趋势和心功能的变化呈正相关（Pearson相关系数为0.54,P=0.002）。阿托伐他汀还可增加Atk的磷酸化,其蛋白磷酸化趋势与eNOS磷酸化的趋势呈正相关性（Pearson相关系数为0.479,P=0.018）。同时,阿托伐他汀可以增加JNK磷酸化水平,和c-Jun的水平,并且两者的蛋白水平趋势呈正相关（Pearson相关系数为0.439,P=0.032）。虽然阿托伐他汀可以增加p53的水平,但是p53蛋白的浓度变化与AMPK磷酸化或者JNK磷酸化的变化没有显著相关（Pearson相关系数为0.360,P=0.051：Pearson相关系数为0.204,P=0.279）。结论：阿托伐他汀可以改善BM-MSCs移植治疗AMI的疗效,可能通过AMPK/eNOS、Akt/eNOS和JNK/c-Jun/p53信号通路发挥作用。

论文目录

• 缩略语表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 阿托伐他汀抑制缺氧无血清诱导的骨髓间充质干细胞凋亡
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 阿托伐他汀提高猪骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死疗效及机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 单磷酸腺苷活化蛋白激酶在心血管系统中的调控作用
• 参考文献
• 个人简历
• 读研期间发表文章
• 致谢