点带石斑鱼组织中一氧化氮合成酶活性及免疫反应性研究

点带石斑鱼组织中一氧化氮合成酶活性及免疫反应性研究

论文摘要

1、研究点带石斑鱼不同组织器官中一氧化氮(NO)含量和不同类型一氧化氮合酶(NOS)活性,采用Griess试剂法测定NO含量,采用化学比浊法测定NOS的活性。研究结果表明:诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在头肾组织中活性最高,依次为肌肉、肝脏、脾脏、肠、胃、胰脏、眼睛、脑、心脏、鳃、中肾。结构型一氧化氮合酶(cNOS)在脑组织中活性最高,依次为眼睛、肠、肝脏、胃、肌肉、头肾、鳃、胰脏、中肾、心脏、脾脏。NO含量在脾脏中最高,依次为肝脏、头肾、中肾、心脏、胰脏、肠、脑、眼睛、胃、鳃、肌肉、血清。2、通过使用免疫组织化学SP(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法)法以及NADPH-d(还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶)酶组织化学染色法测定神经型一氧化氮合成酶(nNOS)在点带石斑鱼各组织中的分布及定位。酶免疫组织化学定位结果表明,nNOS阳性结果分布在间脑中的神经元,大脑和中脑的神经元和神经纤维中,小脑的颗粒细胞、阳性纤维和普肯野细胞;视网膜的视锥视杆细胞层,外核层,外网层、内核层、内网层、节细胞层和视神经纤维层;中肾组织的近曲小管和远曲小管;头肾组织的前肾间组织和网状细胞;心脏组织的神经纤维和心肌纤维;脾脏的血窦中的红细胞和脾索的网状细胞;肠组织的纹状缘、神经元和基膜;肝脏中的肝细胞和中央静脉壁;肌肉组织中的肌纤维处;鳃丝的上皮细胞,沿动脉血管延伸的神经纤维和红细胞。NADPH-d酶组织化学染色结果表明,NOS分布在间脑神经元、大脑和中脑的神经元和神经纤维、小脑神经元和颗粒细胞、神经纤维和普肯野细胞;视网膜中视锥视杆细胞层,外核层,外网层,内核层、内网层、节细胞层和视神经纤维层;中肾的近曲小管、远曲小管,神经纤维和血管壁中;头肾的前肾间组织、动脉血管的神经纤维、神经元和网状细胞;心脏的心肌纤维和神经纤维;脾脏的红细胞和网状细胞中;肠组织中的纹状缘、神经元和肌间神经纤维;肝脏的肝细胞、中央静脉、神经纤维,枯否氏细胞,小叶间动脉,小叶间静脉和小叶间胆管;肌肉组织的肌纤维处;鳃丝的上皮细胞,沿动脉血管延伸的神经纤维、红细胞、泌氯细胞和柱细胞。利用Western Blot技术对各组织中的nNOS蛋白分子量进行测定,结果表明,脑,眼睛,头肾、中肾、心脏、鳃和胃中有三条带,对应分r量分别为130kD、120 kD和80kD,而在肠、脾脏、肝脏、胰脏和肌肉中有两条带,对应分子量120kD和80kD。3、研究刺激物对点带石斑鱼血清和头肾NO含量和iNOS活性的影响,刺激物包括:脂多糖(LPS)、酵母多糖(zymosan)和嗜水气单胞菌。体外培养头肾巨噬细胞,利用LPS刺激头肾巨噬细胞,检测NO含量和iNOS活性,结果表明,LPS能诱导巨噬细胞iNOS的表达,催化产生大量的NO,L-单甲基-精氨酸(L-NMMA)和L-硝基-精氨酸甲脂(L-NAME)能抑制NO的产生,iNOS最大活性出现在刺激后的12h,NO的最大产量出现在刺激后的24h。利用zymosan和嗜水气单胞菌对点带石斑鱼进行腹腔注射,检测头肾和血清中的NO含量和iNOS活性,结果表明,iNOS最大活性同样出现在刺激后的12h,NO的最大产量也出现在刺激后的24h。这证明体内和体外的iNOS活性增长和NO含量的增加具有同样的趋向性,体内和体外的iNOS活性增长和NO含量的增加具有同样的时效性。4、利用免疫组化sp法以及NADPH-d酶组织化学染色法测定诱导型一氧化合酶(iNOS)在点带石斑鱼各组织中的分布及定位。酶免疫组织化学定位结果表明,iNOS主要存在于脑的阳性神经元、神经纤维和小脑浦肯野细胞中;视网膜的视锥视杆细胞层,外网层,内核层、内网层、竹细胞层和视神经纤维层中;中肾组织中近曲小管、远曲小管和巨噬细胞中;头肾的前肾间组织、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞中;心脏中心肌纤维;脾脏的巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞中;肠中纹状缘和巨噬细胞;肌肉组织中肌纤维处;肝脏的肝细胞和枯否氏细胞中;鳃的神经纤维、上皮细胞和血细胞中。NADPH-d酶组织化学染色结果表明,NOS分布在脑的神经元、神经纤维和小脑浦肯野细胞;视网膜的视锥视杆细胞层、外核层、外网层、内核层、内网层、节细胞层和视神经纤维层;中肾的近曲小管、远曲小管和巨噬细胞中:头肾的前肾间组织、淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞;心脏中心肌纤维处;脾脏中巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞中;肠组织中纹状缘和巨噬细胞;肌肉中肌纤维处;肝脏的肝细胞和枯否氏细胞中;鳃组织中神经纤维,上皮细胞和泌氯细胞中。利用Western Blot技术对各组织中的iNOS蛋白分子量进行测定,试验结果显示,iNOS在脑、眼睛、肌肉、鳃、头肾、胃、肝脏、脾脏、中肾、肠中有120 kD和80 kD两条带,在心脏只有一条带80kD,而在胰脏中没有带出现。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  • 1 NOS的分类、结构特征以及机理
  • 1.1 NOS的分类
  • 1.2 NOS的结构特征
  • 1.3 NOS的作用机理
  • 1.4 NOS抑制剂
  • 2 NO的合成以及分布
  • 3. NO的生物学作用
  • 3.1 NO在心血管系统中的作用
  • 3.2 NO在免疫系统中的作用
  • 3.3 NO在神经系统中的作用
  • 3.4 NO在消化系统中的作用
  • 3.5 NO在呼吸系统中的作用
  • 4 鱼类中NO的免疫防御功能
  • 5 水产动物NOS活性和免疫反应性研究
  • 6 本课题的研究目的和意义
  • 7 主要研究内容和预期目标
  • 第二章 点带石斑鱼组织器官中一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性的测定
  • 1 材料和方法
  • 1.1 试验材料
  • 1.2 试验方法
  • 1.3 数据分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 NO测定结果
  • 2.2 iNOS和cNOS活性测定结果
  • 3 讨论
  • 3.1 NO在不同组织器官中的含量
  • 3.2 iNOS在不同组织器官中的活性
  • 3.3 cNOS在不同组织器官中的活性
  • 第三章 点带石斑鱼组织器官中神经型一氧化氮合成酶免疫反应性研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 试验材料
  • 1.2 样品采集及处理
  • 1.3 试验方法
  • 2 结果
  • 2.1 酶免疫组织化学定位
  • 2.2 NADPH-d组织化学染色
  • 2.3 蛋白免疫印迹结果
  • 3 讨论
  • 3.1 nNOS在神经系统中的分布
  • 3.2 nNOS在免疫器官中的分布
  • 3.3 nNOS在其它组织中的分布
  • 3.4 蛋白免疫印迹分析
  • 第四章 刺激物对点带石斑鱼血清和头肾NO含量和iNOS活性的影响
  • 1 材料和方法
  • 1.1 试验材料
  • 1.2 试验方法
  • 1.3 数据分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 酵母多糖和嗜水气单胞菌对鱼血清和头肾中NO含量的影响
  • 2.2 酵母多糖和嗜水气单胞菌对血清和头肾中iNOS活性的影响
  • 2.3 LPS对体外培养巨噬细胞NO产量的影响
  • 2.4 LPS对体外培养巨噬细胞iNOS活性的影响
  • 3 讨论
  • 3.1 酵母多糖对血清和头肾中NO含量和iNOS活性的影响
  • 3.2 嗜水气单胞菌对血清和头肾中NO含量和iNOS活性的影响
  • 3.3 LPS对巨噬细胞NO含量和iNOS活性的影响
  • 3.4 抑制剂对巨噬细胞NO含量和iNOS活性的影响
  • 第五章 点带石斑鱼组织器官中诱导型一氧化氮合成酶免疫反应性研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 试验材料
  • 1.2 样品采集及处理
  • 1.3 试验方法
  • 2 结果
  • 2.1 酶免疫组织化学定位
  • 2.2 NADPH-d组织化学染色
  • 2.3 蛋白免疫印迹结果
  • 3 讨论
  • 3.1 iNOS在神经系统中的分布
  • 3.2 iNOS在免疫器官中的分布
  • 3.3 iNOS在其他组织中的分布
  • 3.4 蛋白免疫印迹分析
  • 第六章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读硕士期间发表论文及参加会议情况
  • 相关论文文献

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