点带石斑鱼组织中一氧化氮合成酶活性及免疫反应性研究

论文摘要

1、研究点带石斑鱼不同组织器官中一氧化氮（NO）含量和不同类型一氧化氮合酶（NOS）活性,采用Griess试剂法测定NO含量,采用化学比浊法测定NOS的活性。研究结果表明：诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在头肾组织中活性最高,依次为肌肉、肝脏、脾脏、肠、胃、胰脏、眼睛、脑、心脏、鳃、中肾。结构型一氧化氮合酶（cNOS）在脑组织中活性最高,依次为眼睛、肠、肝脏、胃、肌肉、头肾、鳃、胰脏、中肾、心脏、脾脏。NO含量在脾脏中最高,依次为肝脏、头肾、中肾、心脏、胰脏、肠、脑、眼睛、胃、鳃、肌肉、血清。2、通过使用免疫组织化学SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）法以及NADPH-d（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶）酶组织化学染色法测定神经型一氧化氮合成酶（nNOS）在点带石斑鱼各组织中的分布及定位。酶免疫组织化学定位结果表明,nNOS阳性结果分布在间脑中的神经元,大脑和中脑的神经元和神经纤维中,小脑的颗粒细胞、阳性纤维和普肯野细胞；视网膜的视锥视杆细胞层,外核层,外网层、内核层、内网层、节细胞层和视神经纤维层；中肾组织的近曲小管和远曲小管；头肾组织的前肾间组织和网状细胞；心脏组织的神经纤维和心肌纤维；脾脏的血窦中的红细胞和脾索的网状细胞；肠组织的纹状缘、神经元和基膜；肝脏中的肝细胞和中央静脉壁；肌肉组织中的肌纤维处；鳃丝的上皮细胞,沿动脉血管延伸的神经纤维和红细胞。NADPH-d酶组织化学染色结果表明,NOS分布在间脑神经元、大脑和中脑的神经元和神经纤维、小脑神经元和颗粒细胞、神经纤维和普肯野细胞；视网膜中视锥视杆细胞层,外核层,外网层,内核层、内网层、节细胞层和视神经纤维层；中肾的近曲小管、远曲小管,神经纤维和血管壁中；头肾的前肾间组织、动脉血管的神经纤维、神经元和网状细胞；心脏的心肌纤维和神经纤维；脾脏的红细胞和网状细胞中；肠组织中的纹状缘、神经元和肌间神经纤维；肝脏的肝细胞、中央静脉、神经纤维,枯否氏细胞,小叶间动脉,小叶间静脉和小叶间胆管；肌肉组织的肌纤维处；鳃丝的上皮细胞,沿动脉血管延伸的神经纤维、红细胞、泌氯细胞和柱细胞。利用Western Blot技术对各组织中的nNOS蛋白分子量进行测定,结果表明,脑,眼睛,头肾、中肾、心脏、鳃和胃中有三条带,对应分r量分别为130kD、120 kD和80kD,而在肠、脾脏、肝脏、胰脏和肌肉中有两条带,对应分子量120kD和80kD。3、研究刺激物对点带石斑鱼血清和头肾NO含量和iNOS活性的影响,刺激物包括：脂多糖（LPS）、酵母多糖（zymosan）和嗜水气单胞菌。体外培养头肾巨噬细胞,利用LPS刺激头肾巨噬细胞,检测NO含量和iNOS活性,结果表明,LPS能诱导巨噬细胞iNOS的表达,催化产生大量的NO,L-单甲基-精氨酸（L-NMMA）和L-硝基-精氨酸甲脂（L-NAME）能抑制NO的产生,iNOS最大活性出现在刺激后的12h,NO的最大产量出现在刺激后的24h。利用zymosan和嗜水气单胞菌对点带石斑鱼进行腹腔注射,检测头肾和血清中的NO含量和iNOS活性,结果表明,iNOS最大活性同样出现在刺激后的12h,NO的最大产量也出现在刺激后的24h。这证明体内和体外的iNOS活性增长和NO含量的增加具有同样的趋向性,体内和体外的iNOS活性增长和NO含量的增加具有同样的时效性。4、利用免疫组化sp法以及NADPH-d酶组织化学染色法测定诱导型一氧化合酶（iNOS）在点带石斑鱼各组织中的分布及定位。酶免疫组织化学定位结果表明,iNOS主要存在于脑的阳性神经元、神经纤维和小脑浦肯野细胞中；视网膜的视锥视杆细胞层,外网层,内核层、内网层、竹细胞层和视神经纤维层中;中肾组织中近曲小管、远曲小管和巨噬细胞中；头肾的前肾间组织、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞中;心脏中心肌纤维；脾脏的巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞中；肠中纹状缘和巨噬细胞；肌肉组织中肌纤维处；肝脏的肝细胞和枯否氏细胞中；鳃的神经纤维、上皮细胞和血细胞中。NADPH-d酶组织化学染色结果表明,NOS分布在脑的神经元、神经纤维和小脑浦肯野细胞；视网膜的视锥视杆细胞层、外核层、外网层、内核层、内网层、节细胞层和视神经纤维层；中肾的近曲小管、远曲小管和巨噬细胞中：头肾的前肾间组织、淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞；心脏中心肌纤维处；脾脏中巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞中；肠组织中纹状缘和巨噬细胞；肌肉中肌纤维处；肝脏的肝细胞和枯否氏细胞中；鳃组织中神经纤维,上皮细胞和泌氯细胞中。利用Western Blot技术对各组织中的iNOS蛋白分子量进行测定,试验结果显示,iNOS在脑、眼睛、肌肉、鳃、头肾、胃、肝脏、脾脏、中肾、肠中有120 kD和80 kD两条带,在心脏只有一条带80kD,而在胰脏中没有带出现。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 NOS的分类、结构特征以及机理
• 1.1 NOS的分类
• 1.2 NOS的结构特征
• 1.3 NOS的作用机理
• 1.4 NOS抑制剂
• 2 NO的合成以及分布
• 3. NO的生物学作用
• 3.1 NO在心血管系统中的作用
• 3.2 NO在免疫系统中的作用
• 3.3 NO在神经系统中的作用
• 3.4 NO在消化系统中的作用
• 3.5 NO在呼吸系统中的作用
• 4 鱼类中NO的免疫防御功能
• 5 水产动物NOS活性和免疫反应性研究
• 6 本课题的研究目的和意义
• 7 主要研究内容和预期目标
• 第二章 点带石斑鱼组织器官中一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性的测定
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 NO测定结果
• 2.2 iNOS和cNOS活性测定结果
• 3 讨论
• 3.1 NO在不同组织器官中的含量
• 3.2 iNOS在不同组织器官中的活性
• 3.3 cNOS在不同组织器官中的活性
• 第三章 点带石斑鱼组织器官中神经型一氧化氮合成酶免疫反应性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 样品采集及处理
• 1.3 试验方法
• 2 结果
• 2.1 酶免疫组织化学定位
• 2.2 NADPH-d组织化学染色
• 2.3 蛋白免疫印迹结果
• 3 讨论
• 3.1 nNOS在神经系统中的分布
• 3.2 nNOS在免疫器官中的分布
• 3.3 nNOS在其它组织中的分布
• 3.4 蛋白免疫印迹分析
• 第四章 刺激物对点带石斑鱼血清和头肾NO含量和iNOS活性的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 酵母多糖和嗜水气单胞菌对鱼血清和头肾中NO含量的影响
• 2.2 酵母多糖和嗜水气单胞菌对血清和头肾中iNOS活性的影响
• 2.3 LPS对体外培养巨噬细胞NO产量的影响
• 2.4 LPS对体外培养巨噬细胞iNOS活性的影响
• 3 讨论
• 3.1 酵母多糖对血清和头肾中NO含量和iNOS活性的影响
• 3.2 嗜水气单胞菌对血清和头肾中NO含量和iNOS活性的影响
• 3.3 LPS对巨噬细胞NO含量和iNOS活性的影响
• 3.4 抑制剂对巨噬细胞NO含量和iNOS活性的影响
• 第五章 点带石斑鱼组织器官中诱导型一氧化氮合成酶免疫反应性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 样品采集及处理
• 1.3 试验方法
• 2 结果
• 2.1 酶免疫组织化学定位
• 2.2 NADPH-d组织化学染色
• 2.3 蛋白免疫印迹结果
• 3 讨论
• 3.1 iNOS在神经系统中的分布
• 3.2 iNOS在免疫器官中的分布
• 3.3 iNOS在其他组织中的分布
• 3.4 蛋白免疫印迹分析
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文及参加会议情况