香蕉果皮带毛和早花突变体的筛选、鉴定及突变机理初步研究

论文摘要

香蕉是世界重要水果之一,世界第四大粮食作物,近5亿人口的主要粮食。香蕉在我国热带亚热带的农业生产中占据重要地位。但由于香蕉栽培品种多为三倍体,杂交育种困难,香蕉新品种的选育工作一直是困扰世界的难题,而有关香蕉育种基础理论的研究更是有限,长期以来,突变育种是香蕉育种的主要途径之一。香蕉果皮带毛嵌合体是“巴西”香蕉中的突变单株,其花梗、果实、雄花苞片等部位均表现有毛-无毛的嵌合特征。以此嵌合体的吸芽为外植体,经过组织培养获得果皮完全带毛、嵌合和无毛的后代,继续以完全带毛植株的吸芽进行组织培养,经过4年的分离和筛选,从香蕉果皮带毛嵌合体分离出稳定的香蕉早花/果皮带毛突变体株系。香蕉早花/果皮带毛突变体在植株形态、果实品质等方面与“巴西”香蕉没有明显差异,但果皮、果柄、苞片和苞片脱落处的疤痕上部都覆盖表皮毛,生长周期比“巴西”香蕉缩短至少3个月,植株相对矮化,产量降低;香蕉突变体果皮上不规则分布着两种表皮毛:长表皮毛和短表皮毛。长表皮毛长度约0.17～0.37mm,密度为16cm-2左右;短表皮毛长度为0.02～0.07mm,密度约190cm-2,这两种类型的表皮毛均为柱型,没有分叉,顶端膨大为半球形。突变体尾蕉上还存在分叉、气球形、葫芦形和2～9节不等的念珠状等多种类型的表皮毛。同一时期,不同部位果皮（子房皮）上的表皮毛发育程度不同,越靠近果束末端,表皮毛的发育越晚,在第49束子房表皮上仅能观察到很小的极少量的突起。当果实接近成熟时,果实上的表皮毛萎缩,部分表皮毛脱落。同时,突变体果束上蓟马的密度比“巴西”低,果皮上蓟马刺伤产生的疤痕也明显少于“巴西”香蕉。利用ISSR和SSR技术对突变体和“巴西”香蕉的基因组DNA进行分析,结果表明两种方法都能显示两者之间的多态性,但数量较少。提取高质量的“巴西”田间叶片、突变体田间叶片和突变体组培苗叶片的基因组DNA,采用包括EcoRI/MseI双酶切、加接头、预扩增和选择性扩增等程序的AFLP技术,在64对E+3/M+3引物中有6对引物扩增出8条多态性片段,4条来自“巴西”香蕉,4条来自突变体;多态性发生在“巴西”香蕉和突变体（田间/组培苗）之间,而突变体田间植株和组培苗之间没有多态性。对AFLP多态片段进行序列分析后发现,8个片段都仅存在很小的阅读框架;其中5个片段存在转录起始因子的结合位点CAAT box,2个片段存在MYB转录因子的结合序列TATCCAY（T/C）motif,1个具有启动子特征的片段还存在果实/种子特异的保守序列TGTCACA、AACAAAC和CATGCA。提取“巴西”和突变体香蕉组培苗叶片的RNA,分离纯化mRNA后,合成cDNA

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Abstract

1 前言

1.1 国内外香蕉生产及常规选育种进展

1.2 香蕉突变体育种

1.3 香蕉突变体育种的局限性

1.4 植物表皮毛发育

1.5 分子标记技术与香蕉育种

1.5.1 ISSR 与 SSR 技术

1.5.2 AFLP 技术

1.6 cDNA-AFLP 与功能基因表达

1.7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 香蕉突变体的分离

2.2.1.1 筛选方法

2.2.1.2 香蕉组织培养条件

2.2.1.3 香蕉离体快繁的过程

2.2.1.4 香蕉组织培养所用培养基配方

2.2.1.5 香蕉组培苗移栽及栽培

2.2.2 突变体植株描述及综合评价

2.2.2.1 植株描述

2.2.2.2 果肉硬度和果皮厚度的测定

2.2.2.3 可溶性固形物、固/酸比的测定

2.2.2.4 矿质元素测定

2.2.2.5 抗蓟马性状调查

2.2.3 果实表皮形态观察

2.2.3.1 电镜扫描

2.2.3.2 数码体视镜观察

2.2.3.3 石蜡切片与显微观察

2.2.4 基因组 DNA 提取

2.2.5 RNA 提取

2.2.6 ISSR

2.2.6.1 优化后的 ISSR PCR 反应体系

2.2.6.2 ISSR PCR 反应程序

2.2.7 SSR

2.2.7.1 优化后的 SSR PCR 反应体系

2.2.7.2 SSR PCR 反应程序

2.2.8 AFLP

2.2.8.1 基因组 DNA 酶解

2.2.8.2 酶解产物加接头

2.2.8.3 预扩增

2.2.8.4 选择性扩增

2.2.9 cDNA－AFLP

2.2.9.1 mRNA 的分离

2.2.9.2 cDNA 一链的合成

2.2.9.3 双链cDNA 合成

2.2.9.4 双链cDNA 酶解

2.2.9.5 接头准备

2.2.9.6 加接头

2.2.9.7 预扩增

2.2.9.8 选择性扩增

2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.10.1 安装电泳装置（BioRad）

2.2.10.2 制备6%凝胶溶液和灌胶

2.2.10.3 安装测序胶

2.2.10.4 上样和电泳

2.2.10.5 聚丙烯酰胺凝胶染色

2.2.11 目的片段的回收

2.2.12 目的片段的克隆与序列测定

2.2.12.1 大肠杆菌感受态的制备

2.2.12.2 DNA 片段与 TA 克隆载体的连接

2.2.12.3 连接产物转化大肠杆菌

2.2.12.4 质粒的提取

2.2.12.5 质粒的酶切鉴定

2.2.12.6 序列测定

2.2.13 核酸序列的分析

2.2.13.1 DNA 序列分析

2.2.13.2 cDNA 序列分析

3 结果与分析

3.1 香蕉果皮带毛突变体的分离

3.2 突变体植株描述及其综合评价

3.2.1 突变体与“巴西”香蕉形态特征比较

3.2.2 突变体与“巴西”香蕉果实品质的比较

3.2.2.1 果肉糖酸含量、硬度和可溶性固形物

3.2.2.2 矿质元素含量

3.3 突变体表皮形态

3.3.1 嵌合体表皮形态特征

3.3.2 突变体不同部位幼果表皮形态特征

3.3.3 突变体同一果实不同部位表皮毛的分布

3.3.4 果皮带毛突变体与“巴西”中期和后期果实表皮形态比较

3.3.5 突变体表皮毛的形态类型

3.4 香蕉突变体和野生型 DNA 多态性分析

3.4.1 突变体香蕉和“巴西”香蕉的 ISSR 分析

3.4.2 突变体香蕉和“巴西”香蕉的 SSR 分析

3.4.3 突变体香蕉和“巴西”香蕉的 AFLP 分析

3.4.3.1 香蕉基因组 DNA 的制备

3.4.3.2 DNA EcoRI/MseI 双酶解及接头的连接

3.4.3.3 预扩增

3.4.3.4 选择性扩增

3.4.3.5 多态片段的回收、克隆

3.4.3.6 重组质粒的酶切鉴定

3.4.3.7 AFLP 多态片段的序列定

3.4.3.8 多态片段的序列分析

3.5 香蕉突变体和野生型基因表达差异的分析

3.5.1 总 RNA 提取和mRNA 的分离

3.5.2 双链cDNA 合成

3.5.3 cDNA-AFLP 分析

3.5.4 差异片段的序列测定及分析

4 讨论

4.1 植物嵌合体与新品种选育

4.2 植物表皮毛的功能与作用

4.3 分子标记技术与香蕉种质鉴定、分类

4.4 植物遗传变异与基因表达分析

5 结论

参考文献

缩略语表

附录 1 主要试剂的配制

附录 2 ISSR 引物序列

附录 3 SSR 引物序列

附录 4 香蕉 AFLP 和cDNA-AFLP 选择性扩增引物组合及扩增情况

附录 5 cDNA-AFLP 差异序列中具有同源基因的片段

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致谢

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