核酸与蛋白质相互作用的AFM单分子力谱研究

论文摘要

核酸与蛋白质是组成生命的主要生物大分子,二者的相互作用构成了诸如生长、繁殖、遗传和代谢等生命现象的基础。从单分子水平上对它们的相互作用进行纳米探测,有利于人们更加深入地理解与调控这些重要的生理过程,是人们解开生命奥秘的关键所在。基于原子力显微镜的单分子力谱技术是一种非常有效的研究分子间/分子内相互作用的方法。本论文首先对单分子力谱的原理和它在生物学领域的应用进行了总结,然后通过对两个核酸-蛋白质体系的研究利用并发展了该力谱方法。这两个核酸-蛋白质体系分别为：（1）长链双螺旋DNA与SSB蛋白（2）烟草花叶病毒中基因组RNA与衣壳蛋白之间的相互作用。本论文的工作围绕以上两个体系并遵从由简入繁的原则展开：一、研究了双螺旋DNA在外力诱导下构象转变的本质以及单股DNA与SSB蛋白的相互作用。以长链双螺旋DNA作为探针,利用单分子力谱的方法并结合单股DNA结合蛋白（SSB）只与单股DNA结合而不与双螺旋DNA结合的特性,研究了双螺旋DNA在较低外力（65 pN左右）诱导下构象转变的本质。二、以更加复杂的完整烟草花叶病毒（TMV）为模型体系,研究基因组RNA与衣壳蛋白之间的相互作用。我们首次将RNA从TMV颗粒中牵拉出来,直接定量测得了基因组RNA与衣壳蛋白之间的结合强度,并证明衣壳蛋白保留在TMV蛋白外壳上而没有随RNA一同被牵拉出来。当外力被撤销后部分RNA能够重新组装回到TMV的蛋白外壳中。三、在上述工作基础上,更加深入地对RNA与衣壳蛋白解离的动力学过程进行了研究。通过测量在不用的pH值及外力加载速率下RNA与衣壳蛋白的断裂力,来描述RNA与衣壳蛋白断裂过程的能垒,获得其动力学信息,揭示RNA从蛋白外壳上解组装的机制。合强度,并证明了衣壳蛋白保留在TMV蛋白外壳中而没有随RNA一同被牵拉出来。当外力被撤销后部分RNA在位于5’端较远的、没有被破坏的RNA-蛋白外壳复合物的作用下,能够重新组装回到TMV的蛋白外壳中。我们还初步考察了环境因素,比如缓冲溶液中的EDTA浓度、pH值以及外力加载速率对RNA与衣壳蛋白相互作用的影响。通过此研究我们将AFM单分子力谱方法拓展到相对复杂生物体系的核酸与蛋白质相互作用的研究中,同时有望将该技术应用到病毒感染机理的研究。在本论文第四章中,仍以烟草花叶病毒为研究模型,更加深入、系统地对RNA与衣壳蛋白解离的动力学过程进行了研究。通过测量在不用加载速率下RNA与衣壳蛋白的断裂力,发现该断裂力是具有加载速率依赖性的。而且,Bell-Evans模型可以很好地拟合我们的实验数据,并给出了RNA与衣壳蛋白的断裂过程的动力学参数并且描述了断裂的能垒。在pH值为4.7的条件下RNA与衣壳蛋白的解离过程由一个能垒控制；在pH值为7.0的条件下断裂过程由两个能垒控制,增加的一个能垒来源于病毒颗粒内壁上无序的突环结构对RNA解离的阻碍作用。

论文目录

• 提要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 基于原子力显微镜技术的单分子力谱
• 1.1.1 单分子力谱仪的原理
• 1.1.2 测量过程及力谱的获得
• 1.1.3 单链拉伸实验及判断标准
• 1.1.3.1 单链拉伸的实验
• 1.1.3.2 单链拉伸的判断标准
• 1.1.4 动态力学谱
• 1.2 单分子力谱在生物领域中的应用
• 1.2.1 DNA分子的拉伸与操纵
• 1.2.1.1 长链DNA拉伸的力学指纹谱
• 1.2.1.2 以长链DNA为探针研究DNA与DNA结合分子的相互作用
• 1.2.1.2.1 DNA-DNA结合药物分子的相互作用
• 1.2.1.2.2 DNA-DNA结合蛋白的相互作用
• 1.2.1.3 DNA齐聚物的拉伸与操纵
• 1.2.1.4 以DNA齐聚物为探针研究DNA与蛋白质的相互作用
• 1.2.2 蛋白质折叠结构的打开
• 1.2.3 多糖分子的构象转变
• 1.2.4 配体-受体识别作用
• 1.2.4.1 几种模型体系的体外研究
• 1.2.4.2 细胞和细菌体系的探测
• 1.3 本论文的研究思路
• 参考文献
• 第二章 在外力诱导下双链DNA构象转变的本质—单股DNA与SSB蛋白的相互作用
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 样品制备
• 2.2.2 单分子力谱实验
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 外力诱导下的双链DNA与SSB蛋白的相互作用
• 2.3.2 拉伸长度、停留时间、盐离子浓度对双链DNA构象转变以及SSB蛋白与单股DNA相互作用的影响
• 2.3.3 解螺旋的双链DNA与SSB蛋白的相互作用
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 烟草花叶病毒中RNA与衣壳蛋白之间的相互作用
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 样品制备
• 3.2.2 单分子力谱实验
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 烟草花叶病毒中RNA从蛋白外壳上解组装
• 3.3.2 验证实验
• 3.3.2.1 WLC模型拟合与poly A RNA叠加
• 3.3.2.2 RNA基因组中相邻AAG序列长度的统计
• 3.3.2.3 RNA水解酶对比实验
• 3.3.3 影响RNA解组装力大小的因素
• 3.3.3.1 溶液pH值对TMV中RNA与衣壳蛋白之间相互作用的影响
• 3.3.3.2 拉伸速率对TMV中RNA与衣壳蛋白之间相互作用的影响
• 3.3.3.3 EDTA可以削弱TMV管口处RNA与衣壳蛋白之间的相互作
• 用
• 3.3.4 RNA的重新组装
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 烟草花叶病毒中RNA与衣壳蛋白解离的动力学研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 样品制备
• 4.2.2 单分子力谱实验
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 在pH值为4.7和7.0条件下RNA与衣壳蛋白断裂力的加载速率依赖性
• 4.3.2 动力学参数的计算
• 4.3.3 在pH值为4.7和7.0条件下RNA与衣壳蛋白解离的机制
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 作者简历
• 博士期间发表的论文
• 博士期间参加的学术会议
• 致谢