大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin引发Balb/c小鼠过敏反应及其机理的研究

论文摘要

摘要食物过敏被视为一种严重的公共营养卫生问题,引起了全球广泛的关注。大豆是人类和动物主要的蛋白质来源之一,但大豆同时也是联合国规定的8类主要致过敏食物之一。近年来研究显示,大豆中的致敏因子极大地影响了幼年动物对蛋白质的有效吸收,而且可以引起人和幼年动物发生过敏反应,因而限制了大豆及其制品在食品和饲料工业中的应用。本研究针对常见的大豆蛋白中的主要过敏成分：大豆球蛋白glycinin和P-conglycinin,运用易致敏的Balb/c小鼠作为试验动物,在不使用免疫佐剂的条件下,通过连续5周的灌胃方式建立过敏试验动物模型,系统研究glycinin和β-conglycinin诱导Balb/c速发型过敏反应的机理,并从粘膜免疫角度探讨glycinin和β-conglycinin引发Balb/c小鼠粘膜变态反应的机理,从而为进一步研究glycinin和β-conglycinin的过敏机理以及预防大豆球蛋白过敏的发生提供科学依据。1.大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin的提取、分离和纯化从脱脂大豆中提取、分离和纯化出大豆球蛋白glcyinin和β-conglycinin。采用免疫法提纯大豆粗蛋白,利用硫酸铵沉淀进行分级盐析除去大豆中的清蛋白,经SephroseCL-6B层析进一步纯化。结果显示,经SDS-PAGE鉴定，glycinin和β-glycinin的纯度达到95%以上。2.建立大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin口服致敏Balb/c小鼠动物模型运用易致敏的Balb/c小鼠作为试验动物,在不存在免疫佐剂的条件下,通过连续5周分别灌胃lmg/ml的glycinin和β-conglycinin建立过敏试验动物模型。采用被动皮肤过敏试验来测定小鼠血清中IgE和抗体反应；荧光测定法测定肠道组织胺的含量；光镜检测上皮细胞和肥大细胞的形态学。结果表明,大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin显著增加了血清中IgE和IgGl的抗体含量以及小肠组胺的含量。肥大细胞的完整率在灌胃28d时降到最低,glycinin组肥大细胞完整率较对照组降低了66%,β-conglycinin组较对照组降低了65.7%；同时肥大细胞脱颗粒现象严重,肠道上皮细胞损坏严重,且血压在灌胃大豆球蛋白后3h时达到最低点,与对照组相比,glycinin组小鼠血压降低了17.6%,β-conglycinin组降低了20.8%。以上结果显示,灌胃大豆球蛋白能够诱导Balb/c小鼠的过敏反应,同时表明Balb/c小鼠是检测大豆球蛋白过敏性的一个合适的试验动物。3.大豆球蛋白glycinin和P-conglycinin引发小鼠速发型过敏反应机理的研究在明确glycinin和β-conglycinin能够引发Balb/c小鼠过敏反应的基础上探讨其诱导小鼠速发型过敏反应的免疫调节机理。分别用0、0.1mg/ml、1mg/ml和10mg/ml的大豆球蛋白灌胃Balb/c小鼠。ELISA法测定小鼠血清中IgE、IgG、IgG1和IgG2a的抗体水平和脾脏细胞上清液中细胞因子的含量；MTT法测定脾脏淋巴细胞增殖情况；Annexin V-FITC法来检测脾细胞凋亡；荧光定量RT-PCR法检测脾脏胞中IL-4、IL-10和IFN-γ,mRNA的表达量。结果表明,0.1mg/ml和1mg/ml的glcyinin与β-conglycinin组小鼠的抗体水平均显著高于对照组（P<0.01）,且在28d时各抗体水平均达到最高。与对照组相比,灌胃0.1mg/ml和1mg/mlglycinin组和β-conglycinin组的小鼠脾细胞上清液均产生较高水平的IL-4、IL-5和IFN-γ（P<0.01）。灌胃1mg/ml的glycinin和β-conglycinin的小鼠脾细胞中细胞因子IL-4和IFN-γ,mRNA表达量显著增加,与对照组相比,glycinin和β-conglycinin组的IL-4mRNA分别提高了1.5倍和1.8倍,IFN-γmRNA分别提高了1.5和1.7倍,同时IL-10比对照组分别降低了0.6倍和0.7倍。研究表明,0.1mg/ml和1mg/ml的大豆球蛋白容易引发小鼠的速发型过敏反应,尤其是1mg/ml的大豆球蛋白引发的过敏反应更为严重。4.大豆球蛋白glycinin和P-conglycinin引发小鼠肠道粘膜变态反应机理的研究探讨了大豆球蛋白造成小鼠口服耐受失败而引发的过敏反应与肠道粘膜免疫之间的调控关系。免疫组化法测定小鼠小肠绒毛CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞的数量及固有层IgA+浆细胞的数量；TUNEL法测定小肠上皮细胞的凋亡率；荧光定量RT-PCR检测小肠组织中IL-4、IFN-γ、IL-10和TGFβ1 mRNA的表达量;双抗夹心法测定小肠液中sIgA的含量。结果显示,与对照组相比,灌胃glycinin的小鼠肠绒毛固有层淋巴细胞（LPL）CD3+和CD4+数量显著高于对照组（P<0.01）,灌胃β-conglycinin的小鼠小肠CD3+和CD8+LPL的数量（P<0.05）以及CD4+LPL的数量（P<0.01）显著高于对照组；同时固有层中整合素α4β7的数量均显著高于对照组；灌胃glycinin的小鼠小肠上皮淋巴细胞（IEL）中CD3+、CD4+数量显著高于对照组（P<0.05）,整合素α4β7的数量也显著高于对照组（P<0.01）,灌胃β-conglycinin的小鼠小肠中CD3+、CD4+、CD8+IEL数量及整合素α4β7的数量显著高于对照组（P<0.01）,CD4+/CD8+IEL比值也显著高于对照组（P<0.05）；显微镜下观察显示试验组小鼠小肠出现连续性阳性染色,固有层中可见大量浆细胞及淋巴细胞等炎性细胞浸润,多见阳性染色的淋巴细胞；且肠组织中IL-4和IFN-γmRNA表达量与对照组相比均显著增加（P<0.01）,而IL-10和TGFβ1 mRNA表达量显著降低；IgA免疫组化结果显示,灌胃glycinin和β-conglycinin组小鼠小肠固有层IgA+浆细胞呈现明显的阳性染色,说明肠道炎症较高。上述结果表明大豆球蛋白引发并刺激了小鼠肠粘膜变态反应的发生。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 食物过敏反应及其机制
• 1.1.1 食物过敏原
• 1.1.2 食物过敏的免疫学机制
• 1.1.3 动物模型
• 1.1.4 食物过敏的临床表现和诊断
• 1.1.5 过敏原的检测技术
• 1.1.6 食品过敏原检测技术未来的发展趋势
• 1.2 大豆过敏原的类型及其研究进展
• 1.2.1 大豆中的过敏原类型及特性
• 1.2.2 大豆过敏原的去除或降低方法
• 1.3 本课题主要研究内容及其意义
• 1.3.1 本研究的目的及意义
• 1.3.2 主要研究内容
• 第二章 大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin分离提取和纯化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 溶液配制
• 2.2.4 仪器设备
• 2.2.5 试验方法
• 2.3 试验结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin Balb/c小鼠致敏模型的建立
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 仪器设备
• 3.2.4 试验动物
• 3.2.5 动物分组及模型建立
• 3.2.6 试验方法
• 3.2.7 统计学处理
• 3.3 结果
• 3.3.1 被动皮肤过敏反应试验（PCA）
• 3.3.2 小肠组织胺的释放
• 3.3.3 小肠中肥大细胞完整率
• 3.3.4 小肠中肥大细胞的形态学观察
• 3.3.5 小鼠肠道形态学观察
• 3.3.6 Glycinin和β-conglycinin对小鼠血压的影响
• 3.3.7 Glycinin和β-conglycinin对小鼠迟发型过敏反应（DTH）的影响
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin引发Balb/c小鼠速发型过敏反应的机理研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 溶液配制
• 4.2.4 仪器设备
• 4.2.5 动物试验设计
• 4.2.6 试验方法
• 4.2.7 统计学处理
• 4.3 结果
• 4.3.1 血清大豆球蛋白特异性抗体的测定
• 4.3.2 脾脏淋巴细胞增殖（MTT）
• 4.3.3 脾脏细胞凋亡检测
• 4.3.4 脾细胞上清液细胞因子含量
• 4.3.5 脾细胞中IL-4、IL-10和IFN-γ mRNA的表达测定
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin引发Balb/c小鼠肠道粘膜变态反应的机理研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试验材料
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 仪器设备
• 5.2.4 试验动物
• 5.2.5 试验方法
• 5.2.6 统计学处理
• 5.3 试验结果
• 5.3.1 肠粘膜Peyer’s结数量的观察
• 5.3.2 小鼠小肠绒毛T淋巴细胞观察及计数
• 5.3.3 小鼠小肠绒毛上皮细胞凋亡检测
• 5.3.4 小肠组织中IL-4、IFN-γ、IL-10和TGFβ1的mRNA表达量测定
• 5.3.5 肠粘膜sIgA的测定
• +浆细胞检测'>5.3.6 小鼠小肠固有层IgA⁺浆细胞检测
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 提示与创新点
• 6.1 提示
• 6.2 创新点
• 参考文献
• 附录
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果