论文摘要
骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）是一类能高度增殖和自我更新,并具有多向分化潜能的成体干细胞。目前,已在人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛和羊等物种进行了研究,证明该类细胞在一定条件下能分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、肝细胞、血管内皮细胞、神经细胞和星形胶质细胞等多种成体细胞。另外,研究还发现BMSCs转染效率较高,是一种理想的核移植供体细胞。因此,BMSCs有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的主要种子细胞之一。但是,迄今关于山羊BMSCs分离培养、冷冻保存以及转基因等方面的系统研究报道甚少。因此,本试验利用黄淮山羊为对象,较系统全面地研究了BMSCs的分离培养、生长特性、细胞表面标志、体外诱导分化能力、冷冻保存体系以及基因转染效率等。具体研究内容如下：1.山羊BMSCs的分离培养和生物学特性研究从增殖情况、基因表达和分化潜力三方面对山羊BMSCs的生物学特性进行研究。采用全骨髓贴壁法分离培养原代BMSCs,结果显示山羊BMSCs体外生长状态良好,镜下可见贴壁细胞增殖明显,培养9d即基本汇合,细胞形态均一,大部分呈梭形；传代后,以计数法检测第1代细胞和第7代细胞增殖水平,并绘制生长曲线,曲线呈“s”形,符合细胞生长的一般规律；取第5代细胞接触抑制2d后用流式细胞仪检测细胞周期,结果89.69%的细胞处于G0/G1期,同期化程度较高；通过免疫荧光法和RT-PCR检测,发现山羊BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106和CD166等表面标志,但是不表达造血干细胞的表面标志CD45；最后,用成骨细胞、脂肪细胞诱导剂成功诱导BMSCs定向分化为成骨细胞和脂肪细胞,鉴定其具有分化能力。2.山羊BMSCs冷冻保存研究从山羊BMSCs冷冻保存时冻存液的种类、浓度和冷冻程序优化其冷冻保存。首先研究冷冻保存对山羊BMSCs生物学特性的影响,结果复苏后细胞的生长曲线依然呈“S”型,同时用流式细胞仪检测接触抑制2d的山羊BMSCs细胞周期,结果显示G0/G1期的细胞达89.45%,与冷冻前比较,差异不明显。然后试验研究了DMSO浓度、蔗糖浓度以及三种冷冻程序对细胞冻存的影响：（1）采用分级冷冻法冷冻细胞,研究含有2.5%、5%和10%DMSO的冻存液对山羊BMSCs冷冻效果的影响,结果,当DMSO含量为2.5%时,复苏后细胞活率为（97.76+1.3）%,显著高于5%和10%试验组,然而三组细胞24 h后的贴壁率差异并不显著；（2）采用分级冷冻法冷冻细胞,在含有10%DMSO的冻存液中,分别添加0.05 M、0.15 M和0.25 M的蔗糖,结果发现这三个试验组复苏后细胞活率差异不显著,另外三组之间24 h贴壁率差异也不显著；（3）采用含有10%DMSO的冻存液,应用三种冷冻程序对山羊BMSCs进行冷冻保存,分别为：分级冷冻法、异丙醇控温盒冷冻法和直接-80℃冷冻法,结果发现直接-80℃冷冻法复苏后细胞活率显著高于其他两组,但是三个试验组24 h贴壁率差异不显著。结果表明,2.5%的DMSO可以满足山羊BMSCs冻存的需要,并且分级冷冻法较适合该细胞的冷冻。3.山羊BMSCs基因转染研究研究山羊BMSCs的基因转染效率。本试验将pEGFP-C1分别转染山羊耳成纤维细胞和山羊BMSCs,进行转染效率比较,结果显示：山羊BMSCs对脂质体LTX较敏感,以敏感细胞的体系进行转染（100μL LDMEM-LG中加入0.25μg质粒、0.5μLPLUSTM Reagents和1.25μL LipofectamineTM LTX）,细胞依然呈纤维样且死亡较少,山羊BMSCs转染效率达（67.91±5.3）%,显著高于山羊耳成纤维细胞转染效率（17.79±3.9）%,说明山羊BMSCs是一种转染效率较高的转基因核移植供体细胞。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 生物学特性论文; 冷冻保存论文; 基因转染论文;