脂肪氧合酶的分离纯化及其催化多不饱和脂肪酸的研究

论文摘要

脂肪氧合酶（Lipoxygenase,EC1.13.11.12,简称LOX）属氧化还原酶。由于大豆中的脂肪氧合酶活性比其它植物中的活性都要高,因此从大豆中提取LOX的效率较高,从而大多数研究都是以大豆中的LOX为模型来进行的。植物产生清香风味成分的基本途径是多不饱和脂肪酸在脂肪氧合酶（LOX）的作用下与O2结合,形成脂肪酸氢过氧化物;后者又作为氢过氧化物裂解酶（HPL）的底物被裂解;随着LOX和HPL酶特异性的不同,将分别产生C6、C9或C10醛。本文研究LOX的提取及纯化方法,得到纯度较高的LOX,对其理化和酶学性质进行了研究,并对第一步LOX反应,在酶反应器和反应条件优化方面,针对反应体系中水-油-气三相共存,传质机理复杂的情况,研究合适的反应条件,提高传质速率,寻求最佳工艺路线,使脂质过氧化物转化率尽可能最大并为HPL制备C6醛风味物质提供良好的基础。LOX分离纯化的研究中,脱脂豆粕经硫酸铵分级沉淀,透析,经DEAE-Sepharose FF柱层析后,比活力从3.54 U/mg提高到105.7U/mg,纯化倍数为29.9,回收率是30.9%。特性研究表明大豆LOX的最适pH值为9.0,在较低温度下酶活能保持较高水平,用双倒数法求得大豆中脂肪氧合酶Km=80.6μmol/L,Vmax=54.2μmol/（L?min）。用HPLC和LC-MS法,确定了LOX催化反应体系的影响因素与氢过氧化脂肪酸产率和催化选择性等方面的关系,得到最优反应条件,以亚麻酸为底物的催化反应,0.025mol/L的亚麻酸和2.5U/ml的酶在pH9.0,4℃,2atm,转速为800r/min的条件下反应1.5h,在该条件下反应转化率为83%,亚麻酸氢过氧化物纯度为87%。以亚油酸为底物的催化反应,0.01mol/L的亚油酸和0.33U/ml的酶在pH9.0,4℃,3atm,转速为800r/min的条件下反应1.5h,在该条件下反应转化率为81.3%,亚油酸氢过氧化物纯度为97%。高底物浓度反应下,0.3mol/L的亚麻酸,0.15% Triton X-100,0.044gBHT和20U/ml的LOX在pH9.0,4℃,2atm的条件下反应1.5h,该条件下反应转化率为81.87%。0.3mol/L的亚油酸,0.2%的Triton X-100,0.08gBHT和15U/ml的LOX在pH9.0,4℃,2atm的条件下反应1.5h,该条件下反应转化率为71.7%。在低底物浓度下,底物为亚油酸时,用纯酶反应的转化率比粗酶稍高,而底物为亚麻酸时,用粗酶或纯酶进行反应,转化率基本没什么变化,然而高底物浓度情况下,不论是以亚油酸还是亚麻酸为底物,用纯酶反应的转化率都比用粗酶的要高,说明在高浓度情况下,用纯酶反应效果较好,可以提高反应转化率。低温下,用乙醇保存的氢过氧化物比未用乙醇保存的氢过氧化物要稳定的多。LOX反应产物的分离鉴定表明,产物除了有脂肪酸氢过氧化物外,还有少量的氧代二烯酸以及羟基酮,除此之外,其他物质还需进一步研究鉴定。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 大豆脂肪氧合酶概述
• 1.1.1 脂肪氧合酶的结构及活性中心结构
• 1.1.2 脂肪氧合酶的反应机理
• 1.2 大豆脂肪氧合酶的分离纯化及其催化反应
• 1.2.1 大豆脂肪氧合酶的分离纯化
• 1.2.2 大豆脂肪氧合酶催化反应在风味成分中的研究现状及应用
• 1.3 立题背景及意义
• 1.4 本论文主要研究内容
• 2 实验材料和方法
• 2.1 材料与设备
• 2.1.1 主要材料
• 2.1.2 主要设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大豆脂肪氧合酶（LOX）的分离纯化及其性质研究
• 2.2.2 大豆脂肪氧合酶催化多不饱和脂肪酸的研究
• 3 实验结果与讨论
• 3.1 脂肪氧合酶的分离纯化及其性质研究
• 3.1.1 提取脂肪氧合酶原料的选择
• 3.1.2 脂肪氧合酶的分离纯化
• 3.1.3 脂肪氧合酶的分子量
• 3.1.4 脂肪氧合酶的等电点
• 3.1.5 动力学性质
• 3.1.6 大豆脂肪氧合酶的最适pH 值
• 3.1.7 大豆脂肪氧合酶的热稳定性
• 3.2 脂肪氧合酶催化多不饱和脂肪酸反应的研究
• 3.2.1 脂肪酸的制备
• 3.2.2 低浓度底物浓度LOX 催化多不饱和脂肪酸反应的研究
• 3.2.3 高浓度底物浓度LOX 催化多不饱和脂肪酸反应的研究
• 3.2.4 粗酶和纯酶对反应转化率的比较
• 3.3 脂肪酸氢过氧化物稳定性的研究
• 3.3.1 乙醇保存情况下脂肪酸氢过氧化物稳定性的研究
• 3.3.2 非乙醇保存下脂肪酸氢过氧化物稳定性的研究
• 3.4 LOX 反应产物的分离鉴定
• 3.4.1 TLC 法对LOX 反应产物的分离鉴定
• 3.4.2 LC-MS 法对LOX 反应产物的分离鉴定
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录1：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录2：实验相关图谱