模拟微重力对K562细胞增殖的影响

论文摘要

研究背景航天飞行导致人体多个系统发生改变,包括血液系统、心血管、前庭、骨骼、肌肉、免疫和内分泌等一系列变化。随着航天技术的发展,人们越来越关注航天带来的这些变化及影响。其中血液学的改变早在很久以前就引起了航天医学家们的重视。他们把这种表现为血浆容量减少,红细胞数量下降,异形红细胞增多的现象统称为“航天贫血症”。研究表明,“航天贫血症”会随着航天飞行时间的延长而加重,而且这种因适应飞行而产生的改变,是否会成为不可逆转的病理状态?早期科学家们只限于对血液学指标的观察,但仅仅是知道红细胞数量的减少,异形红细胞增多等这些是不够的,为解决并预防航天过程中这些不利因素,为实现空间科学的进一步发展和探索,近几年来科学家们已经开始着手对“航天贫血症”的发生机制进行研究与探讨。因航天试验研究花费大,且实验条件不好控制,目前已有许多国内外实验室开始使用微重力生物反应器来模拟微重力环境进行各种实验。美国国家航空航天局（NASA）发明的旋转式细胞培养系统（Rotary Cell Culture System, RCCS）是一种重复性高、复杂的、三维的体外培养系统。它的低剪切力、高的物质传递效率和微重力的独特环境,使我们在普通实验室的组织培养内也能生长出三维细胞组织。目前它已成为公认的模拟微重力环境的培养装置。经阅读国内外文献,许多研究显示RCCS模拟的微重力环境能抑制造血细胞（如CD34+细胞、K562细胞）的增殖和分化。细胞增殖和分化是一个复杂的过程,受许多种因素的调控,是由各信号传导通路、细胞因子、转录因子以及癌基因等共同作用的结果。目前,对于微重力影响细胞增殖与分化的机制还有待于进一步探讨和研究。K562细胞是一种人红白血病细胞,因其在受到多种因素的诱导后具有向终末红系、巨核细胞和巨噬细胞系分化的能力,常被作为研究细胞增殖与分化的一种模型。增殖是分化的前提。细胞的增殖与细胞内信号传导通路的活化及有关基因的表达相关,根据国内外的研究,目前我们已经了解与细胞增殖有关的信号通路有细胞磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K/Akt）、成视网膜母细胞瘤蛋白及转录因子E2F （pRb/E2F）、促分裂素原活化蛋白激酶（MAPKs）等。哺乳动物的MAPKs分为三组,其中细胞外信号调节蛋白激酶（ERK1/2）在调节红系增殖和分化中均具有重要作用。ERK通路促进细胞增殖现已被广泛地证实,实验证明ERK1/2能调节c-myc、c-fos、p21CIP1、cyclinD1、cyclinD3等一系列细胞周期调节蛋白。抑制ERK1/2活性能阻滞CD34+红系祖细胞的增殖,以及其红系分化,并诱导其发生凋亡。红细胞生成是一个复杂的生理过程,它是由多种基因尤其是红系造血生长因子及转录因子共同调控。氯化高铁血红素（hemin）即含铁原卟啉Ⅸ,它是提供血红蛋白携氧能力的重要成分。hemin可作为红系细胞分化诱导剂,诱导红系祖细胞、人红白血病K562细胞血红蛋白的合成。K562细胞就如同干/祖细胞,具有多向分化潜能,它的分化取决于一系列的特异性转录因子,这些转录因子变化消长态势已经确定了它分化的方向。当给予外部刺激（如hemin）时,它的定向分化就开始“启动”。转录因子GATA-1,作为GATA家族中的一员,它在红系分化和成熟过程中起着非常关键的作用。GATA-1基因的启动子有两个,分别为远端的红系启动子和近端的睾丸启动子。在启动子上游存在GATA-1结合位点,构成GATA-1基因的强启动子,这种强启动子是为充分活化及与体内自身红系核蛋白结合所必需。在原始细胞向红系分化开始时,GATA-1远端启动子被激活后,总GATA-1表达上调,进一步启动细胞向红系的分化。我们的实验即采用RCCS-1模拟微重力培养K562细胞,观察培养过程中K562细胞的变化,内容分为两个部分,第一部分观察了K562细胞增殖情况,及与增殖有关的信号通路的变化；文章的第二部分我们还补充了微重力作用对K562细胞分化的影响：第一部分模拟微重力对K562细胞增殖的影响及相关机制目的：航天员在航天飞行条件下出现“航天贫血症”,该部分实验建立在利用RCCS-1模拟微重力环境,在地面培养K562细胞的基础上,研究微重力环境对细胞增殖过程的影响及其相关机制。方法：采用美国国家航空航天局（NASA）旋转式细胞培养系统（Rotary Cell Culture System-1, RCCS-1）模拟微重力环境培养人红白血病K562细胞,研究其增殖情况。1)K562细胞的培养将K562细胞用含10%FBS的RPMI1640培养基于细胞培养箱中培养,2～3d细胞传代1次。取对数生长期的传代细胞用于实验,调整细胞浓度至1×105个/mL；2) RCCS-1模拟微重力培养K562细胞本实验使用RCCS-1（美国,Synthecon）模拟微重力。将传代K562细胞置入50mL高截面纵横比容器中,调整转速至10～12rpm,于细胞培养箱中培养；3)细胞计数分别取RCCS-1和正常重力条件下培养的K562细胞,用牛巴氏计数板在光学显微镜进行计数；4)细胞周期检测分别收集RCCS-1和正常重力条件培养同一时间点的K562细胞,用流式细胞术检测细胞周期；5) Western bloting检测ERK1/2的表达取不同时间点RCCS-1培养的K562细胞,用磷酸化蛋白提取试剂盒提取蛋白后,用Western bloting方法检测细胞外信号调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）表达及其磷酸化水平。结果：1)模拟微重力环境培养的K562细胞的增殖速度显著低于地面对照组（24h:t=0.480, P=0.020; 48h:t=0.026, P=0.001）;同时还显著抑制细胞周期进程,使其停滞在G0/G1期（t=0.001,P=0.001）；2)模拟微重力环境培养的K562细胞ERK1/2的磷酸化水平随时间逐渐下降（F=53.111,P=0.002）。结论：模拟微重力环境抑制K562细胞的增殖,使细胞周期阻滞于G0/G1期,这可能是由模拟微重力作用下ERK1/2磷酸化水平下降所导致。第二部分模拟微重力对K562细胞分化的影响目的：航天飞行会引起“航天贫血症”,其核心是红细胞数量和质量下降,该部分实验仍是建立在RCCS模拟微重力环境,在地面培养K562细胞的基础上,观察微重力环境对细胞红系分化的影响。方法：采用RCCS-1模拟微重力环境,培养K562细胞,并利用hemin诱导其向红系分化。1)K562细胞培养及RCCS-1培养同前,加hemin刺激分化；2)联苯胺染色分别取各时间点模拟微重力和正常重力条件下培养的K562细胞,进行联苯胺染色,计数联苯胺阳性细胞率；3) Western bloting检测GATA-1的表达分别回收模拟微重力和正常重力条件下培养的K562细胞,提取蛋白后,用Western bloting方法检测GATA-1表达水平。结果：1)hemin能诱导K562细胞向红系分化,相同条件下培养,hemin刺激时间越长,向红系分化越多（Normal:F=387.997,P=0.000; RCCS:F=64.068, P=0.000）;同一时间,微重力作用使hemin诱导的K562细胞红系分化较正常重力显著减少（48h:t=0.000,P=0.006;72h:t=0.710,P=0.002）;2)通过Western bloting检测发现,随着时间延长,两组的GATA-1表达均增加（Normal:F=35.408,P=0.002; RCCS:F=59.002,P=0.000）;且RCCS-1模拟微重力组中,hemin诱导的K562细胞GATA-1的表达与正常重力组无明显差异（6h:t=1.832,P=0.416; 12h:t=0.005,P=0.234; 24h:t=6.578, P=0.053）。结论：模拟微重力环境抑制hemin诱导的K562细胞分化,红细胞生成减少,证实在微重力环境下“航天贫血症”的发生。微重力未影响GATA-1的表达,推测K562细胞分化受抑可能与GATA-1无关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1.微重力对K562细胞影响的研究现状
• 2.与细胞增殖有关的信号通路
• 3.调控细胞分化的有关因素
• 第一部分 模拟微重力对K562细胞增殖的影响及相关机制
• 1.1 材料与方法
• 1.2 实验结果
• 1.3 讨论
• 第二部分 模拟微重力对K562细胞分化的影响
• 2.1 实验材料与方法
• 2.2 实验结果
• 2.3 讨论
• 全文总结
• 研究论文总结
• 展望
• 参考文献
• 中英文缩略词表
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 统计合格证明