ERK信号转导通路相关基因在拟穴青蟹卵巢发育中的作用研究

论文摘要

拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是我国东南沿海重要的经济养殖蟹种之一。随着青蟹人工养殖业及生物技术的发展，对青蟹卵子质量及卵巢发育机制的研究越来越受到重视。细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）信号转导途径是一条古老的信号转导通路，普遍存在于真核生物，并广泛参与细胞的生长、增殖、分化、生殖、凋亡和应激等生理过程。有研究表明，ERK信号转导通路在卵母细胞的减数分裂过程中具有作用。本研究通过对实验室已构建的拟穴青蟹性腺EST数据库进行生物信息学分析得到ERK信号转导通路相关基因部分片段，利用SMART-RACE等技术克隆获得ERK2、Ras相关蛋白1b前体（Ras-related protein Rap-1b precursor，Rap-1b precursor）、PAK1互作蛋白（1PAK1interacting protein1，PAK1-IP1）和G蛋白偶联受体89（G protein-coupled receptor89，GPR89）四个基因全长cDNA序列，并对其在拟穴青蟹各组织及卵巢发育不同阶段的表达进行了荧光定量PCR分析。对Sp-erk2和Sp-gpr89mRNA在拟穴青蟹卵巢发育各阶段具体表达情况做了原位杂交分析。结果如下：（1）Sp-erk2的cDNA序列全长1516bp，包括5’非编码区19bp、3’非编码区399bp（含18bp的polyA部分）和1098bp的开放阅读框，可编码365个氨基酸，预测其分子量为42kDa，等电点为5.98。荧光定量PCR结果显示，Sp-erk2基因在青蟹卵巢中的表达量显著高于其他各组织器官（P<0.05），它在卵巢发育各时相均有表达，且表达量随着卵巢的发育成熟逐渐增加，其中，第六期（O6，GSI>10）表达量最高，与前四期呈现显著差异（P<0.05），与第五时相（O5）未出现差异（P>0.05）。原位杂交结果表明，Sp-erk2mRNA在拟穴青蟹卵巢发育初期只在滤泡细胞表达，而在相对成熟期开始在滤泡和卵母细胞内都有表达。（2）Sp-rap-1b precursor的cDNA序列全长1078bp，包括5’非编码区142bp、3’非编码区381bp（含17bp的polyA部分）和555bp的开放阅读框，该开放阅读框可编码184个氨基酸，预测分子量约为20.76kDa，等电点为5.65。荧光定量PCR结果显示，Sp-rap-1bprecursor基因在拟穴青蟹血液中的表达量最高，其次是卵巢，它在卵巢发育各时相均有表达，且表达量随着卵巢的发育成熟逐渐增加，在第六期（O6）表达量达到最高，与前五期呈现极显著差异（P<0.01）。（3）Sp-pak1-ip1的cDNA序列全长，1252bp，包括5’非编码区31bp、3’非编码区57bp（含31bp的polyA部分）和1164bp的开放阅读框，该开放阅读框可编码387个氨基酸，预测分子量约为43.12kDa，等电点为6.23。荧光定量PCR结果显示，Sp-pak1-ip1基因在青蟹卵巢中的表达量显著高于其他各组织器官（P<0.05），它在卵巢发育各时相均有表达，且总体看来，表达量随着卵巢的发育成熟逐渐增加，其中，第六期（O6）表达量最高，与前五期呈现显著差异（P<0.05）。（4）Sp-gpr89的cDNA序列全长2053bp，包括5’非编码区114bp、3’非编码区541bp（含18bp的polyA部分）和1398bp的开放阅读框，该开放阅读框可编码465个氨基酸，预测其分子量为54kDa，等电点为8.95。荧光定量PCR结果显示，Sp-gpr89基因在青蟹卵巢中的表达量极显著高于其他各组织器官（P<0.01），它在卵巢发育各时相均有表达，且总体看来，表达量随着卵巢的发育成熟逐渐增加，其中，第六期（O6）表达量最高，与前五期呈现显著差异（P<0.05），前五期表达量较低。原位杂交结果表明，Sp-gpr89mRNA在早期拟穴青蟹卵母细胞的细胞质有表达，而在较成熟卵母细胞的细胞膜附近和细胞核中也有表达，尤其是核仁较多。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 拟穴青蟹的生物学特征和自然分布
• 1.2 MAPK 信号转导途径简介
• 1.2.1 ERK 信号通路
• 1.2.2 JNK 信号通路
• 1.2.3 p38 信号通路
• 1.2.4 ERK5 信号通路
• 1.3 ERK 信号通路研究进展
• 1.3.1 ERK 信号通路在脊椎动物卵母细胞发育中的作用研究进展
• 1.3.2 ERK 信号通路在海洋无脊椎动物卵母细胞发育中的作用研究进展
• 1.3.3 ERK 信号通路在海洋无脊椎动物其他方面的作用研究进展
• 1.4 本研究的目的与意义
• 1.5 主要研究内容和技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物与材料准备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 总 RNA 的抽提（RDP 法）
• 2.2.2 文库 ESTs 序列分析
• 2.2.3 引物设计与合成
• 2.2.4 SMART-RACE 技术克隆基因 cDNA 全长
• 2.2.5 割胶纯化
• 2.2.6 质粒连接转化
• 2.2.7 重组质粒筛选与检测
• 2.2.8 质粒测序及全长基因验证
• 2.2.9 生物信息学分析
• 2.2.10 实时荧光定量 PCR
• 2.2.11 石蜡切片
• 2.2.12 HE 染色
• 2.2.13 原位杂交
• 第3章 结果
• 3.1 总 RNA 的抽提结果
• 3.2 文库筛选结果
• 3.3 RACE-PCR 扩增结果
• 3.4 从头到趾 PCR 扩增结果
• 3.5 基因序列分析
• 3.5.1 Sp-erk2 基因序列分析
• 3.5.2 Sp-rap-1b precursor 基因序列分析
• 3.5.3 Sp-pak1-ip1 基因序列分析
• 3.5.4 Sp-gpr89 基因序列分析
• 3.6 各组织器官的表达
• 3.7 卵巢发育各时相的表达
• 3.8 原位杂交分析
• 3.8.1 原位杂交分析 Sp-erk2 在卵巢发育各时相的表达
• 3.8.2 原位杂交分析 Sp-gpr89 在卵巢发育各时相的表达
• 第4章 讨论
• 4.1 Sp-erk2 基因
• 4.2 Sp-rap-1b precursor 基因
• 4.3 Sp-pak1-ip1 基因
• 4.4 Sp-gpr89 基因
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文