论文摘要
椎间盘退变为腰背痛主要原因之一,其退变主要是由于椎间盘细胞减少和细胞外基质成份的改变,尽管并没明确椎间盘内细胞的性质,但是研究表明:髓核细胞与软骨细胞在某些方面有很多共性。近年来研究表明:细胞移植可以达到组织功能上的修复,所以此方法最有希望成为治疗椎间盘退变的最佳办法。因为干细胞可以向软骨样细胞方面分化,所以大部分学者主要通过改变细胞外环境等来研究骨髓间充质干细胞向软骨样细胞分化。最近研究表明:人体脂肪组织中的脂肪干细胞含量较丰富,而脂肪干细胞在不同的获取技术下可分化为软骨样细胞,如转基因和不同生长因子联合诱导脂肪干细胞向软骨样绍胞分化技术。所以我们设计这个试验就是为了探索比较体外培养的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)和脂肪干细胞(Adipose Stem Cells,ASCs)变化,以及碱性成纤维绉胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,BFGF)对其代谢的影响。方法1.抽取日本大耳白兔骨髓,用全骨髓培养法进行BMSCs的体外培养、扩增,取日本大耳白兔肩胛间的脂肪组织,在0.075%Ⅱ皎原酶溶液中下剪碎并消化1小时(37℃),所得的消化液过滤离心获取脂肪干细胞,进行体外单层培养扩增,所收集的骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞分别用DMEM、DMEM/F12(2:1)、α—MEM培养,倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞的形态改变,分别比较兔骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞的数量。2.当细胞传三代后,胰蛋白酶消化收集的脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞沉淀以2×105/ml接种型24cm2的培养瓶里,用软骨诱导培养基(Chondrogenic Medium,CM)进行诱导,CM的组成:1.25mg/ml牛血清白蛋白、10ng/ml TGF-β1、100nmol/L地塞米松、50μg/mL维生素C、100μg/mL丙酮酸钠、40μg/mL脯氨酸、1%ITS-plus(10 mg/ml胰岛素,6.7 mg/ml亚硒酸钠,5.5 mg/ml转铁蛋白,2ng/ml乙醇胺)的DMEM/F12(2:1)培养液3。兔骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞分为4组后分别进行诱导培养三周,即A组,BMSCs+CM;B组,BMSCs+CM+5ng/ml BFGF;C组,ASCs+CM;D组,ASCs+CM+5ng/mlBFGF,测定培养液上清羟脯氨酸含量和35SO42-基掺入量。结果1.α—MEM培养基比DMEM、DMEM/F12(2:1)制备的BMSCs和ASCs所需时间大大缩短。2.单层培养:单层培养的BMSCs和ASCs增殖较快贴壁较牢且生成细胞集落,然而在CM诱导后,细胞增殖较漫,贴壁不牢,且细胞没有集落生成。3.诱导后的BMSCs和ASCs的形状趋向于类圆形,B组的细胞数量比A组的细胞多,D的细胞数量比C组的细胞多,B组比A组表达的羟脯氢酸增加、35SO42-摄入量增加,D组分别比C组表达羟脯复酸增加、35SO42-摄入量增加。而D组表达羟脯氢酸和35SO42-摄入量与B组表达羟脯氢酸和35SO42-摄入量无差别。结论α-MEM培养基比DMEM、DMEM/F-12更适合兔骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞的单层培养,添加BFGF的软骨诱导液可以增加诱导后兔骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞的代谢,脂肪干细胞可作为髓核组织工程种子细胞的替代物。
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