细菌纤维素对兔耳增生性瘢痕影响的实验研究

论文摘要

研究背景增生性瘢痕（hypertrophic-scar, HS）是创伤后,尤其是深度烧伤后最常见的一种人类特有的病理性愈合现象。创伤后机体将启动一系列修复程序,瘢痕愈合是有多种细胞和细胞因子参与修复的过程,其中尤以成纤维细胞最为重要,成纤维细胞（fibroblast, FB）的异常增殖和含Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质（extracellar matrix, ECM）成分的过度沉积、排列紊乱及大量的粘多糖堆积导致瘢痕的形成,所以成纤维细胞的生物学行为被认为是创伤愈合与瘢痕形成的决定性因素。19世纪60、70年代Mancini等先后定义这种失控的瘢痕组织：高出皮肤平面但局限在原损伤范围内的为增生性瘢痕。Muir等提出另外的观点,认为增生性瘢痕是局限在原创缘内,不能自动消退,切除后易复发。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,由于增生的瘢痕高出皮肤表面、骚痒、刺痛、色素沉着及挛缩,常常严重影响患者的外观及功能,给患者的身体和精神带来严重损害,对它的预防及治疗一直是医学领域急待解决的一个难题,通过不断的努力我们在瘢痕的防治上取得了一定的成绩,其手段主要有：手术治疗、激素注射、压迫治疗、放射治疗、冷冻治疗和硅胶薄贴膜等其它药物治疗。目前临床上对于瘢痕的非手术治疗中,类固醇激素,特别是醋酸曲安奈德是一种公认疗效确切的药物,常用于瘢痕的局部注射,类固醇激素能有效抑制瘢痕胶原的合成,提高胶原酶活性,并促使胶原分解,但目前存在以下不足：①疼痛；②局部注射后药物的扩散不均；③目前的药物剂量及使用方法不易控制,长期使用激素的全身副作用明显；④瘢痕内注射只适用于小范围注射,扩大注射面积会受到单次剂量的限制。所以在瘢痕非手术治疗中,一种无痛的,局部药物贴膜应用是较为理想的方法,在当今,尽管对增生性瘢痕的发病机制和治疗手段进行了大量的研究,但目前仍没有理想的结果。基于上述原因,寻找一种方便有效的瘢痕治疗方法一直是医学工作者奋斗的目标。近几年,应用于增生性瘢痕的生物材料得到医学界的广泛关注其中细菌纤维素更是关注的焦点。细菌纤维素（Bacterial Cellulose,简称BC）是目前最细的天然纤维,属于纳米级纤维,大小仅为人工合成纤维的1/10,从化学组成上看,细菌纤维素与植物纤维素都是由葡萄糖以p-1,4-糖普键连接而成的高分子化合物。其结构、理化特性和生化特性等皆与植物纤维素有较大的差异。因为BC具有独特的生物亲和性、相容性、可降解性、适应性和无过敏反应性以及高的持水性和结晶度、良好的纳米纤维网络、高的张力和强度,尤其是良好的机械韧性,这些优良的特性,使细菌纤维素有着广泛的商业用途,如扬声器的振动膜、食品添加剂、渗透汽化膜、纸张性能增强剂、伤口护理敷料等。所以该材料有望成为一种优良的创伤愈合敷料。根据文献报道,从兔耳创面上皮化到逐渐出现增生,并在持续一定时间后又逐渐消退的过程来看,兔耳创伤愈合与人类创伤愈合的发生、发展过程相似。国内外已有学者曾报道细菌纤维素对皮肤创伤的促愈作用方面的相关实验研究,但是细菌纤维素是否能够对HS有治疗作用尚无人研究,正基于此我们设计了本实验。本实验内容分为两部分：1.兔耳增生性瘢痕动物实验模型的建立。动物瘢痕模型是进行瘢痕研究最有用的工具之一,在以往的研究中一般采用成纤维细胞体外培养体系,包括单层培养和三维培养体系来对瘢痕进行研究,再就是通过临床观察来总结瘢痕的防治经验,这些研究方法都有一定的缺憾：成纤维细胞体外培养体系是体外实验,无法很好的模拟体内环境和条件；临床观测无法细致的研究瘢痕的发生、发展、转归。这些缺点都为更深入的研究瘢痕造成了无法逾越的障碍,因此,建立一种有效的动物模型一直是国内外医学工作者努力的方向。1997年Morris等报道：利用兔耳成功建立了增性瘢痕模型,并证实此模型产生的增生性瘢痕类似于人类增生性瘢痕,能量化的评价药物对瘢痕的作用。2.细菌纤维素对兔耳增生性瘢痕影响的实验研究。在增生性瘢痕面贴敷细菌纤维素后观察不同处理后第0,14,21,28,42,56d瘢痕面大体形态学变化、组织学变化、羟脯氨酸（Hpr）含量,通过实验研究为细菌纤维素的临床运用提供基础理论依据。目的1.了解兔耳创面愈合后可否发生类似人类增生性瘢痕样的改变。2.观察细菌纤维素对兔耳增生性瘢痕的疗效,以证实其在减轻瘢痕中所起的作用。方法实验一：建立兔耳增生性瘢痕模型。取成年新西兰白兔30只,以3%戊巴比妥钠（30mg/kg）静脉麻醉后用圆规在每只兔耳皮肤腹侧面刻画出5个直径为1.5cm的圆,内外侧各2个,耳根部1个,每个间隔约1.0cm,避开血管,切除圆内皮肤及其下软骨膜,保留软骨,每只兔子两只兔耳有10个创面,30只兔子共300个兔耳创面。实验二：细菌纤维素作用于兔耳增生性瘢痕的实验研究。术后第21d左右兔耳创面上皮化且瘢痕增生明显。此时根据每只兔耳5个瘢痕面随机给予不同处理方式设计组别：A、B、C、D、E组；A组瘢痕面贴BC（1：5）、B组瘢痕面贴BC（1：6）、C组瘢痕面贴BC（1：8）、D组瘢痕面贴疤痕贴（阳性对照）、E组瘢痕面未贴任何材料且瘢痕自然生长（阴性对照）。又按观察时间点不同将30只兔子分为6组,每组5只,在给予兔耳瘢痕面不同处理方式后第0d、第14d、第21d、第28d、第42d、第56d观察每组5只兔子耳朵瘢痕增生情况,大体形态学观察及瘢痕厚度测量、组织学光镜下观察瘢痕组织成纤维细胞数量和胶原纤维结构和α-SMA表达量、羟脯氨酸（Hpr）含量检测。结果1.大体形态观察：给予兔耳瘢痕面不同处理方式后, A、B、C组和阳性对照D组第14d以前瘢痕面积和厚度均有增加,瘢痕组织颜色增红,质地都有变硬,阴性对照E组约第21d瘢痕厚度增大到顶峰,各组在高峰期后瘢痕逐渐软化,A、B、C组瘢痕面积减小、厚度降低、颜色减弱强度低于阳性对照D组但高于阴性对照E组。各观察时间点A、B、C、D、E组瘢痕组织厚度方差分析结果（F=21.871,P<0.001）,差异具有统计学意义；A、B、C三组两两之间差异不具有统计学意义（P>0.05）；A、B、C三组与阳性对照D组两两之间比较,A、B组与阳性对照D组两两之间差异具有统计学意义（P<0.001）,C组与阳性对照D组差异不具有统计学意义（P>0.05）;A、B、C三组和阴性对照E组差异均具有统计学意义（P≤0.05）；同时阳性对照D组和阴性对照E组差异也具有统计学意义（P<0.001）。2.组织学观察：兔耳创面愈合后初期各组瘢痕明显高出周围的正常皮肤,真皮组织增生明显,表皮下有大量结缔组织增生,增生的真皮中可见大量成纤维细胞,扩张的毛细血管,较多细胞外基质。不同处理后第14d A、B、C组真皮层变薄,浅层以胶原纤维聚集为主,呈杂乱无序的排列,深层与软骨平行排列,毛细血管管腔部分闭塞,成纤维细胞数达到高峰,其量较阴性对照E组明显减少,但稍多于阳性对照D组；处理后第21dA、B、C组可见中量增殖的成纤维细胞,中量规则排列的胶原纤维,各组均有程度不等的炎细胞浸润,同时可见较多的上皮细胞和毛细血管,此时阴性对照E组有大量增殖的成纤维细胞,大量不规则的粗大胶原纤维呈漩涡状排列或结节状排列,成纤维细胞数达到高峰；处理后第28,42,56d各组成纤维细胞数含量较前减少,A、B、C三组成纤维细胞数量分别比较A>B>C（P≤0.05）,A、B、C三组胶原纤维结构比较差异不具有统计学意义（p>0.05）,A、B、C组胶原排列较阴性对照E组整齐,但仍次于阳性对照D组。各组.a-SMA表达量测定：各组在不同处理后第0dα-SMA表达为一般阳性,随着时间延长,各组α-SMA表达数量呈上升趋势, A、B、C、D组第14d达到最高峰,而E组中α-SMA的高峰期表达阳性持续到第21d,在高峰期E组表达呈强阳性、A、B、C组中表达呈阳性、D组表达呈弱阳性,再随着时间的延长,高峰期后各组α-SMA阳性细胞表达数量减少,其中E组减少最小,其他各组减少较大,据此阳性表达强度D<C<B<A<E组,表达量差异具有统计学意义（P≤0.05）。3.增生性瘢痕Hpr含量：不同处理方式后各组Hpr含量均呈现先增后减的趋势,A、B、C、D组在处理后第14d左右Hpr含量达到高峰期,E组在处理后第21d达到高峰,各处理后时间点A、B、C、D、E五组Hpr含量方差分析结果显示差异具有统计学意义（F=50.666 P<0.001）；A、B、C三组两两之间差异不具有统计学意义（P>0.05）；A、B、C三组与阳性对照D组两两之间比较,A、B组与阳性对照D组两两之间差异具有统计学意义（P≤0.05）,C组与阳性对照D组差异不具有统计学意义（P>0.05）；A、B、C三组和阴性对照E组差异均具有统计学意义（P<0.001）；同时阳性对照D组和阴性对照E组差异也具有统计学意义（P<0.001）。结论1.本实验兔耳腹面的全层皮肤缺损愈合后,可以产生与人增生性瘢痕的组织学结构类似的增生块,增生块的持续时间也与人的增生性瘢痕持续时间相似,进一步验证了增生性瘢痕动物模型。2.外用细菌纤维素敷料有效抑制了兔耳创面愈合后增生性瘢痕的形成,效果比较明显。3.外用细菌纤维素敷料减轻兔耳增生性瘢痕的效果不如疤痕贴片明显。4.吸水性比例为1：8的细菌纤维素为抑制兔耳增生性瘢痕的最适敷料,效果最明显。5.细菌纤维素敷料有望成为一种新型的减轻增生性瘢痕的医用敷料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 兔耳增生性瘢痕动物实验模型的建立
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 细菌纤维素对兔耳增生性瘢痕影响的实验研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 主要英文缩写词索引
• 综述
• 参考文献
• 实验照片
• 攻读硕士学位期间成果
• 致谢
• 统计学合格证明