定位限制性酶解对大豆分离蛋白表面性质及结构特性的影响

论文摘要

大豆分离蛋白（SPI）本身具有一定的表面性质（乳化性、起泡性）,但不是很理想,利用酶法修饰可以提高SPI的表面性质。由于不同蛋白酶对SPI作用位点不同和水解程度的不同,蛋白酶作用后SPI的表面性质也有所不同。而SPI所有表面性质的变化归根结底是由SPI的结构发生了变化而产生的。所以从分子角度来了解SPI酶解前后结构特性的变化及其与表面性质间的关系是十分重要的。课题选取作用位点分别为碱性氨基酸的胰蛋白酶、亲水氨基酸的木瓜蛋白酶、底物广泛的米曲霉蛋白酶和疏水氨基酸的枯草杆菌中性蛋白酶修饰SPI,测定SPI经蛋白酶修饰后随水解度的增加,表面性质、结构性质的变化情况,从而探讨SPI结构特性与表面性质间的关系。首先根据单一蛋白酶作用位点和水解程度不同导致SPI水解物表面性质存在差异,研究不同蛋白酶修饰SPI,随水解度的增加表面性质变化情况。试验结果表明:对于乳化性来说,胰蛋白酶修饰SPI乳化活性较水解前有所提高,在DH为3%时提高幅度最大,提高了5.26%,枯草杆菌中性蛋白酶修饰的SPI乳化活性随水解度增加先增大后减小,在DH为5%时有最大值,较原料提高了14.27%,而木瓜蛋白酶和米曲霉蛋白酶修饰的SPI乳化活性较原料没有提高。4种酶修饰SPI后得到的乳化稳定性都是降低的。4种酶修饰SPI起泡性比原料都有不同程度的提高,其中胰蛋白酶修饰SPI随水解度的增加起泡能力提高,最大提高幅度为22.03%,木瓜蛋白酶在DH为3%时提高最大,较原料提高了25%,米曲霉蛋白酶修饰SPI起泡力提高得最少,最大提高幅度仅为13.56%,枯草杆菌中性蛋白酶作用SPI的起泡性在DH=8%时最高,较水解前增加14.52%,泡沫稳定性除胰蛋白酶修饰的SPI随水解度增加而提高外,其他三种酶修饰的SPI的泡沫稳定性均随水解度的增加而明显下降。不同蛋白酶修饰SPI具有上述不同的表面性质主要与蛋白质在界面处吸附特性有关。界面张力的降低程度反映蛋白质的表面吸附能力,对4种蛋白酶水解前后的水解液表面张力进行随时间延长测定。结果为:4种酶修饰SPI在不同水解度时表面张力下降的幅度不同。原料表面张力在180min内降低幅度为7.90%,木瓜蛋白酶修饰SPI在DH为9%表面张力降低的幅度比原料的小,其他三种酶在各水解度时表面张力下降的幅度均比原料大,其中以枯草杆菌中性蛋白酶在DH为9.5%和胰蛋白酶在DH为5%时表面张力下降的幅度最大,因此产生很好的起泡性。4种蛋白酶修饰SPI乳化体系界面的蛋白吸附量顺序为是胰蛋白酶>木瓜蛋白酶>枯草杆菌中性蛋白酶>米曲霉蛋白酶,而且胰蛋白酶修饰SPI的乳化活性也较其他蛋白酶高,说明界面蛋白吸附量与乳化活性间存在着一定的关系。蛋白质膜的黏度与蛋白质乳化和起泡的稳定性有密切的关系。胰蛋白酶修饰的SPI水解液的黏度与乳化体系的粘结性较原料有较大提高,而其他三种蛋白酶修饰的SPI的水解液的黏度与乳化体系的粘结性都随水解度的增加而降低。这些黏度和粘结性上的差异表现出来的是胰蛋白酶修饰SPI的泡沫稳定性和乳化稳定性有所提高,其他三种酶修饰后的SPI的泡沫稳定性和乳化稳定性明显降低。影响蛋白质的表面性质除了上述的吸附特性外还有与蛋白质结构有关的一些结构特性。通过对4种蛋白酶修饰SPI结构特性的变化的研究得到如下结论:表面疏水性能够反映出蛋白质疏水基团暴露以及连续疏水区域的形成情况。对4种蛋白酶修饰SPI前后的表面疏水性进行测定,结果为:胰蛋白酶修饰SPI比原料表面疏水性提高,而木瓜蛋白酶、米曲霉蛋白酶和枯草杆菌中性蛋白酶修饰后SPI表面疏水性随着水解度的增加而不断下降,这些影响SPI的乳化活性。对4种蛋白酶修饰的不同水解度时的水解液的Zeta-电位进行测定,结果显示:蛋白酶修饰SPI后Zeta-电位均较水解前低,但下降的程度不同。胰蛋白酶修饰后SPI的zeta-电位降低,而泡沫稳定性提高,二者变化规律呈负相关,而木瓜蛋白酶、米曲霉蛋白酶和枯草杆菌中性蛋白酶水解后zeta-电位较水解前低,且变化趋势与水解液泡沬稳定性变化规律呈正相关。这种差异可能是来自不同的蛋白酶修饰SPI结构发生不同的变化,结合SPI吸附特性与表面性质间关系说明酶修饰后如果能够带来SPI适于界面吸附的的结构,那么Zeta-电位的适度减少会有利于产生稳定的泡沫。蛋白质经酶修饰后由于肽键断裂使得分子变小,研究4种蛋白酶修饰前后SPI粒度的变化,得到以下结论,酶修饰后（DH=5%）SPI粒度较原料明显降低,不同蛋白酶修饰SPI的粒度减小程度不同,在DH为5%粒度由大到小分别为胰蛋白酶﹥木瓜蛋白酶﹥米曲霉蛋白酶﹥枯草杆菌中性蛋白酶。酶修饰后枯草杆菌中性蛋白酶修饰的SPI粒度最小,说明此时它的分子最小,而且枯草杆菌中性蛋白酶修饰SPI在界面处的吸附量较高,这些可能是它在DH为5%时具有较好的乳化活性但稳定性较差的原因。此外,从胰蛋白酶修饰SPI的差示量热仪（DSC）研究的热特性结果可以看出,蛋白质的变性热焓随水解度的增加而增加。说明SPI水解后蛋白质的结构更松散无序,这种结构特性有利于界面吸附,产生好的表面性质。在单一酶修饰后SPI结构和表面性质变化的基础上,选取胰蛋白酶和木瓜蛋白酶进行复配,并测定复配酶修饰前后SPI的表面性质及结构特性,继续探讨复配酶修饰SPI结构特性与表面性质间关系。试验结果显示:当酶的添加量为胰蛋白酶:木瓜蛋白酶=2:1时,具有较单一蛋白酶修饰优的表面性质。而且蛋白酶在此比例下复配修饰SPI随着水解度的增加,表面疏水性、水解液的黏度、乳化体系的粘结性都比胰蛋白酶单独修饰时略小,而比木瓜蛋白酶修饰SPI时明显增加,复配酶修饰后的SPI的粒度在DH为5%时比胰蛋白酶和木瓜蛋白酶大,在界面处的蛋白吸附量也高于单一酶修饰SPI。这些结果都进一步说明:SPI较高的表面疏水性、黏度以及助于蛋白质在界面吸附的松散无序的结构有利于SPI产生好的表面性质。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 大豆蛋白质概述
• 1.1.1 大豆蛋白质的主要成分
• 1.1.2 大豆蛋白质氨基酸组成
• 1.1.3 大豆分离蛋白简介
• 1.1.4 大豆蛋白的营养保健功能
• 1.1.5 大豆蛋白的加工和应用
• 1.1.6 大豆蛋白的发展趋势
• 1.2 大豆蛋白的结构特性
• 1.2.1 大豆蛋白的一级结构
• 1.2.2 大豆蛋白的高级结构
• 1.3 大豆蛋白的表面性质
• 1.3.1 大豆蛋白乳化性及乳化稳定性
• 1.3.2 大豆蛋白起泡性及泡沬稳定性
• 1.4 大豆蛋白改性
• 1.4.1 大豆蛋白改性方法
• 1.4.2 酶修饰对大豆蛋白功能性的影响
• 1.5 酶修饰蛋白质结构与乳化性的关系
• 1.5.1 蛋白质表面张力对乳化性的影响
• 1.5.2 蛋白质的疏水性对乳化性影响
• 1.5.3 蛋白质的柔性对乳化性影响
• 1.6 酶修饰蛋白质结构与起泡性的关系
• 1.6.1 蛋白质平均疏水性对起泡性的影响
• 1.6.2 蛋白质柔性对起泡性的影响
• 1.7 国内外大豆蛋白功能特性与结构特性关系的研究
• 1.7.1 酶修饰蛋白质功能性质的研究
• 1.7.2 酶修饰蛋白质功能性质与结构间关系的研究
• 1.8 课题研究的意义及研究内容
• 1.8.1 立题意义
• 1.8.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 原料与设备
• 2.1.1 原料
• 2.1.2 酶制剂
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 试验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 原料成分的测定
• 2.2.2 蛋白酶活力的测定（SB/T 10317-1999）
• 2.2.3 水解液的制备
• 2.2.4 功能性质的测定
• 2.2.5 蛋白质表面张力的测定
• 2.2.6 蛋白吸附量的测定
• 2.2.7 蛋白质表面疏水性的测定
• 2.2.8 蛋白质表面电荷的测定
• 2.2.9 蛋白质粒径的测定
• 2.2.10 蛋白质物性分析
• 2.2.11 蛋白质热特性的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 定位限制性酶解与大豆分离蛋白表面性质的关系
• 3.1.1 胰蛋白酶与大豆分离蛋白表面性质
• 3.1.2 木瓜蛋白酶与大豆分离蛋白表面性质
• 3.1.3 米曲霉蛋白酶与大豆分离蛋白表面性质
• 3.1.4 枯草杆菌中性蛋白酶与大豆分离蛋白表面性质
• 3.2 酶修饰大豆分离蛋白吸附特性与表面性质的关系
• 3.2.1 表面张力与表面性质关系
• 3.2.2 乳化体系蛋白吸附量与表面性质关系
• 3.2.3 酶修饰SPI 水解液黏度分析
• 3.2.4 酶修饰SPI 乳化层粘结性分析
• 3.3 酶修饰大豆蛋白蛋白结构特性与表面性质的关系
• 3.3.1 表面疏水性与表面性质关系
• 3.3.2 酶修饰SPI 的zeta-电位与表面性质间的关系
• 3.3.3 酶修饰SPI 粒径分析
• 3.3.4 定位限制性酶解–表面性质–结构特性三者关系的分析
• 3.4 复配酶修饰SPI 结构特性与表面性质关系研究
• 3.4.1 复配酶种类的确定
• 3.4.2 复配酶比例的确定
• 3.4.3 复配酶修饰SPI 结构特性与表面性质关系
• 4 讨论
• 4.1 蛋白质吸附动力学与其表面性质间的关系
• 4.2 蛋白质表面疏水性与其表面性质间的关系
• 4.3 蛋白质表面电荷与其表面性质间的关系
• 4.4 蛋白质柔性与其表面性质间的关系
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文