DPPⅣ酶抑制减轻大鼠肺移植缺血再灌注损伤的差异蛋白组学研究

论文摘要

背景：肺移植（lung transplantation, LT）是当前治疗终末期肺部疾病的唯一有效方法,自1983年第一例成功的临床异体肺移植完成,二十多年来,肺移植技术越来越多的运用于临床并取得了长足的发展。现全球每年肺移植数量超过2000例,截止至2010年,全球158个中心行各类肺移植术共32652例,平均中位生存期5.3年,五年生存率达到了52%,十年生存率达29%。肺移植的生存率随着各种肺保护技术,抗排斥反应技术,及综合学科技术的进步逐渐提高[1]。然而,围手术期死亡仍然是造成肺移植失败的一个主要因素,据统计,肺移植围手术期死亡的主要原因是肺缺血再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion Injury, I/R Injury）引起的原发性移植物功能障碍（Primary Graft Dysfunction, PGD） [2]。尽管手术技术、肺保护技术、重症监护技术不断提高,肺缺血再灌注损伤诱发的原发性移植物功能障碍仍然是肺移植早期死亡的主要病因[3]。发生在移植术后72小时内的非特异性肺泡及间质损伤、肺水肿、低氧血症是肺缺血再灌注损伤的主要表现[4]。过去的20年,缺血再灌注损伤的机制越来越清楚地被阐明,新型肺保护液及肺保护技术的运用使得原发性移植物功能障碍的发生率从90年代初的30%降低至目前的12%左右[2]。然而,肺组织相对于其他实质性脏器有其自有的生理特性,肺组织对缺血及其他外源性环境刺激更为敏感,供肺的获取与保护较其他实质性脏器更为严格。真正适合作为供肺的来源的器官数量也远远少于诸如肝,肾,心等实质性脏器[5]。据统计,约3/4的终末期肺部疾病患者在等待合适的供体的过程中就已死亡[6],开发新型的具有保护甚至恢复作用的肺保存药物可以减轻移植术后缺血再灌注损伤的发生率,并扩大供肺的获取来源,具有十分重要的临床意义。T淋巴细胞表面分化抗原CD26/DPPⅣ是一个相对分子质量为110kDa的多功能Ⅱ型跨膜糖蛋白,其具有二酰二肽酶活性,并在多种细胞,如上皮细胞、T淋巴细胞和内皮细胞等表面表达,其在肺组织中也发现了较高的表达[7]。之前我们的研究发现,通过抑制供肺二肽酰肽酶Ⅳ（DPPⅣ酶）的活性能够明显地减轻大鼠移植肺的I/R损伤,并在短期内（2 h）达到改善移植肺功能（pulmonary function）的作用[8-9]。然而抑制供肺DPPⅣ酶活性对术后较长时间段肺功能的影响以及其减轻移植肺I/R损伤的具体机制尚不清楚,推测可能与CD26/DPPⅣ对炎症反应的调节作用及其底物对肺功能的保护作用有关[10]。本实验旨在探讨抑制供肺DPPⅣ酶活性对大鼠肺移植术后较长时间段肺功能的影响,并运用差异蛋白质组学（proteomics）技术找出供肺DPPIV酶抑制后肺组织的差异蛋白表达,探究DPPIV酶活性减轻肺移植术后缺血再灌注损伤的机制。目的：建立大鼠原位异体肺移植模型（rat lung transplantation model）,研究供肺DPPⅣ酶活性抑制对大鼠肺移植术后较长时间段内（7d）肺功能的影响,并运用差异蛋白质组学技术找出供肺DPPⅣ酶抑制后（1d）肺组织的差异蛋白表达,探究DPPⅣ酶活性抑制减轻肺移植术后缺血再灌注损伤的机制。方法：以SD大鼠作为试验动物,运用改良的三套管法建立大鼠原位异体左肺移植模型。运用DPPⅣ酶特异性抑制剂AB192灌注并保存供肺18h后行移植术,观察其对肺移植术后缺血再灌注损伤及长期肺功能的影响。将运用AB192灌注保存的进行肺组织与对照组供肺行蛋白组学研究,即利用双向凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide electrophoresis,2D-PAGE）分离两组总蛋白,通过图像分析寻找表达差异的蛋白点,对其进行MALDI-TOF质谱分析。对经质谱鉴定的蛋白质ATⅢ应用酶联免疫法对其含量进行鉴定,研究并验证其对肺缺血再灌注损伤的保护作用。结果：建立了稳定大鼠原位肺移植模型。对照组大鼠至术后第7天全部死亡,实验组（DPPⅣ酶特异性抑制组）的大鼠均存活至术后第7天。与对照组比较,各实验组的PIP值降低（P<0.05）,PO2值升高（P<0.05）,W/D值降低（P<0.05）,MPO活性及MDA含量降低（P<0.05）,并且随着时间的推移,实验组的上述指标不断改善,至术后第7天,各项检测值接近正常。运用差异蛋白质组学技术找出供肺DPPⅣ酶抑制后肺组织的差异蛋白表达,比较术后第1d两组供肺组织2D-PAGE图谱,得到差异蛋白点87个。对其中15个差异蛋白点进行质谱肽质量指纹图分析,鉴定出多个差异蛋白。其中9个差异蛋白均在实验组中过表达,而在对照组组织中低表达或不表达,6个在对照组中过表达。发现ATⅢ对肺组织缺血再灌注损伤有保护作用。结论：特异性的DPPⅣ酶抑制能够明显的减轻大鼠肺移植术后移植肺的缺血再灌注损伤,并有促进肺功能恢复作用。通过2-DE蛋白电泳成功的建立了大鼠肺组织2-DE图谱,并发现了多个差异蛋白表达,鉴定了其中15个蛋白质。发现了多个对肺功能有保护作用的蛋白及多种细胞信号转导通路蛋白。其中ATⅢ可能是DPPⅣ酶可能存在的对肺功能有保护作用的底物。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分:大鼠原位异体肺移植模型的建立
• 一 材料和方法
• 二 结果
• 三 结论
• 四 讨论
• 附图
• 第二部分:DPPⅣ酶活性抑制对大鼠肺移植术后长期肺功能的影响
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 结论
• 四 讨论
• 第三部分:DPPⅣ酶抑制减轻I/R损伤的蛋白质组学研究
• 一 材料和方法
• 二 结果
• 三 结论
• 四 讨论
• 第四部分:ATⅢ对大鼠肺缺血再灌注损伤的影响
• 一 材料和方法
• 二 结果
• 三 结论
• 四 讨论
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录 研究生期间论文发表情况
• 致谢