论文摘要
骨关节炎（osteoarthritis, OA）是由多种因素引起的关节软骨的退行性病变及关节腔内骨赘形成并伴随关节周围滑膜炎症的一种关节疾病。年龄、肥胖、性别、关节创伤、炎症、遗传等多种因素都参与到OA的发生及进展中,但是目前OA的发病分子机制尚不明确。研究表明,转化生长因子-β （transforming growth factor β, TGF-β）信号通路、Wnt信号通路以及蛋白酶类、microRNA、转录因子、补体等不同类型的信号通路和分子都参与到OA的发生及进展过程中。细胞衰老是多种退行性疾病发生的根源。衰老的细胞形态发生改变,细胞周期停滞,代谢减缓并且分泌大量的基质降解酶类。包括氧化应激在内的多种外在应激刺激都可能引起细胞衰老,称之为应激诱导的衰老。p53不仅是著名的肿瘤抑制蛋白,它还作为应答外在刺激的重要效应分子参与调控细胞的衰老。氧化应激导致的损伤可以引起p53的活化,活化后的p53一方面通过调控促氧化酶类和抗氧化酶类的表达,降低细胞自身的抗氧化能力,另一方面则通过调节细胞周期抑制蛋白p21和p16的表达,抑制细胞周期进程,从而参与调控细胞衰老。OA的发生被认为与关节软骨细胞的衰老密切相关。临床OA患者的关节软骨细胞发生了显著的衰老现象。体外细胞实验表明,当软骨细胞受到异常的应激刺激时,异常的代谢活动会产生过多的活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）。当软骨细胞内ROS的水平超过自身抗氧化能力时,就会引起端粒缩短、细胞大量分泌基质降解酶类,导致衰老的发生。这与在OA患者中观察到软骨细胞的衰老表型相一致,但是在体内,关节软骨细胞氧化应激发生的分子机制尚未阐明,氧化应激所致的软骨细胞衰老与OA发生及进展之间的确凿因果关系也需进一步明确。10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（hosphatase and tensin homology deleted on chromosometen, PTEN）是一个重要的抑癌分子,它通过负向调控磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3-kinase, PI3K）的功能,抑制丝氨酸／苏氨酸激酶Akt的磷酸化活化,调节细胞的增殖、分化、凋亡和迁移等等。体外研究表明,PI3K/Akt信号通路可以促进软骨细胞胞外基质的合成并抑制凋亡的发生。因此,人们普遍认为PI3K/Akt信号通路的激活在OA发生中可能具有积极的作用。但在进化过程中,PI3K/Akt信号通路最保守的功能却是调节细胞的代谢并进一步决定细胞寿命。在多种生物体中都已证实,通过抑制PI3K/Akt信号通路,降低细胞代谢速率从而延缓细胞衰老。那么,在OA的发生及进展中,关节软骨细胞中PI3K/Akt信号通路是否发生激活?持续激活的PI3K/Akt信号通路是增强了软骨细胞修复和抗凋亡的能力、促进胞外基质的合成,从而抑制OA的发展,还是使软骨细胞走向早衰的境地,乃至起始OA的发生?我们发现人类OA患者的关节软骨细胞中磷酸化Akt和磷酸化Pten的表达普遍升高,表明人OA患者中PI3K/Akt信号通路出现了异常活化。在对大鼠半月板切断术（destabilization of the medial meniscus, DMM）诱发OA的模型中,同样检测到术后关节软骨细胞中磷酸化Akt和磷酸化Pten迅速且持续的高表达。这两方面结果提示PI3K/Akt信号通路的异常活化在OA的发生及进展中存在普遍性。为了确证PI3K/Akt信号通路的持续激活是否是OA发生的直接原因,我们通过软骨细胞特异性Cre转基因小鼠（Col2a-Cre）和Pten条件打靶小鼠（Pterfl/fl）交配,获得了在软骨细胞中特异性Pten基因敲除小鼠（Col2a-Cre;Pterfl/fl）。 Pten敲除小鼠的关节软骨细胞中PI3K/Akt信号通路持续激活,成年的Pten敲除小鼠逐步表现出驼背、步履蹒跚、关节僵硬等OA大体表现。通过番红“O”染色,我们观察到Pten敲除小鼠发生了与人类OA十分类似的疾病表型：Pten敲除小鼠1月龄时关节软骨结构完整,未有明显异常改变；4月龄时关节软骨变薄,软骨表面略显粗糙；8月龄时就可以明显的观察到关节软骨区域性的磨损脱落；12月龄时则大部分关节软骨磨损殆尽,裸露出软骨下骨。对8周Pten敲除小鼠实施DMM则加速了OA的发生,使OA的病理表现提前。此外,我们还在关节软骨细胞中敲除了Aktl,阻断其介导的PI3K/Akt信号通路。软骨细胞特异性Aktl敲除小鼠的关节软骨与野生型对照相比没有明显差异,但是在DMM手术诱发OA的情况下,Aktl敲除小鼠术后关节结构仍旧保持完整,关节表面的磨损明显减轻,表明阻断PI3K/Akt信号通路的活化可有效抑制OA的发生。综合上面的实验结果,我们首次提供了遗传学证据证明了PI3K/Akt信号通路异常与OA发生的因果关系。接下来我们通过OxyIHC和OxyBlot的方法检测到Pten敲除小鼠关节软骨细胞中蛋白质发生氧化的程度比野生型对照更为显著。我们同样也在DMM诱发OA的小鼠模型中发现关节软骨细胞内蛋白质氧化程度显著升高的现象。蛋白质氧化程度升高提示关节软骨细胞内氧化应激的发生。氧化应激的发生是诱发细胞衰老的重要原因之一。我们通过SA-β-gal衰老染色以及对衰老指示分子磷酸化p53的检测,发现与对照相比,Pten敲除小鼠的关节软骨细胞发生了显著的衰老现象,而在DMM诱发OA的小鼠模型中也检测到了发生早衰的关节软骨细胞。N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine, NAC）是一种抗氧化剂,可以有效阻断氧化应激的发生。我们发现,通过持续灌注NAC药物有效地抑制了Pten敲除小鼠关节软骨细胞的衰老,并阻断了Pten敲除小鼠的OA表型。这些结果表明PI3K/Akt信号通路过度激活导致的氧化应激是OA发生的重要原因。在本研究中,我们通过综合利用PI3K/Akt信号通路的多种基因敲除小鼠,完全在体内生理状态下研究PI3K/Akt信号通路异常与OA发生之间的因果联系,首次提供了体内的遗传学证据证明,PI3K/Akt信号通路的过度激活通过使关节软骨细胞发生氧化应激从而导致OA的发生。这些研究结果为深入理解OA发生的分子机制提供了新的线索。