脑星形细胞瘤患者特异血清microRNA表达谱的筛选及临床价值评价

论文摘要

星形细胞瘤（astrocytoma）是神经系统最常见的难治性原发性神经肿瘤,约占神经上皮肿瘤的75%,其分为WHOⅠ-Ⅳ级,其中Ⅰ级为良性,Ⅱ-Ⅳ级为恶性,Ⅱ级具有发展到更高级别的倾向。高级别星形细胞瘤多呈浸润性生长,手术难以根治,复发率高,中期生存率极低。目前临床上对于高级别的星形细胞肿瘤主要采用手术、放射治疗及化疗等综合疗法,但预后差,复发率100%。组织病理学是诊断星形细胞肿瘤的金标准,但组织属创伤性检出,难以实现肿瘤的早期诊断和治疗效果的适时监控。CT、MRI及其增强扫描诊断是临床常用的诊断方法,但由于星形细胞肿瘤影像学表现的复杂性、多样性及不典型性,影像学诊断水平仍不能使人满意。血标本的收集是无创伤性的,而且取材方便,不过目前临床上尚无星形细胞肿瘤特异诊断指标,因此寻找星形细胞肿瘤特异生物标志物迫在眉睫。微小核糖核酸（microRNA, miRNA）是一类长约19-24个核苷酸的非编码单链小分子RNA,通过与靶mRNA序列的3’端非翻译区以碱基配对方式完全或不完全互补结合,抑制靶基因表达或促使靶基因降解。miRNA与多种病理活动尤其是肿瘤密切相关,它在肿瘤发生、发展中发挥着抑癌基因或癌基因样的作用。最近研究发现,人血清中存在丰富、稳定的miRNA,而且一些肿瘤患者血清miRNA表达谱发生特异性改变,提示血清miRNA作为一种新的无创伤性肿瘤标志物的潜能。但是目前尚未见星形细胞肿瘤患者的相关报道。目的：检测、分析星形细胞肿瘤患者血清miRNA表达谱,筛选出特异变化的血清miRNA,评价其在预测、诊断、分级及预后的价值,以探讨niRNA作为星形细胞肿瘤特异分子标志物的可能性。方法：首先运用Solexa测序技术对未经治疗的44例高级别恶性星形细胞瘤患者（WHOⅢ-Ⅳ级）和43例年龄、性别匹配的正常人组成的两份混合血清进行全基因组miRNA测序和表达量测定；然后运用实时荧光定量PCR技术（quantitive realtime PCR, RT-qPCR）对差异表达的miRNA在单个血清样本中（33例Ⅲ-Ⅳ和33例正常对照）进行复筛,筛选出在患者血清中显著变化的一组miRNA;再用RT-qPCR技术对筛选出的一组miRNA在55例Ⅲ-Ⅳ中进行验证,以获得稳定表达变化的一组miRNA;将该组miRNA进一步对星形细胞瘤Ⅰ级（15例）、Ⅱ级（55例）及星形细胞增生（14例）血清进行检测。以上所有样本均为术前血清,并以80例正常血清作对照。另外,又对14例恶性星形细胞肿瘤术后血清进行检测。最后通过聚类分析和ROC曲线等评价niRNA的临床价值。结果：Solexa测序发现,高级别恶性星形细胞瘤患者与正常对照的血清miRNA占血清所有小分子RNA的比例分别是51.55%,21.77%。其中50种nniRNA在患者中的拷贝数与对照相比差异在2倍以上（35种下降,15种上升）。RT-qPCR技术对初筛出的50种miRNA在复筛组发现,有7种miRNA包括miR-15b*, miR-23a, miR-133a, miR-150*, miR-197, miR-497和miR-548b-5p的浓度在患者血清中显著下降（p<0.001）。验证组结果进一步证实,7种miRNA下降仍然十分显著（p<0.001）。其中各有几种miRNA在不同级别之间也有显著差异。聚类分析结果显示,7种miRNA的组合对Ⅰ级和正常人的正确划分率为100%和82.5%；对Ⅱ级和正常人正确划分率分别为96.4%和91.3%；对Ⅲ-Ⅳ级与正常人正确划分率分别为97.4%和91.3%。另外,这7种miRNA的组合可以把Ⅰ和Ⅱ级完全分开。ROC曲线分析显示,对于Ⅰ级和正常人7种miRNA的AUC在0.892～1.000间,其对Ⅱ级和正常人的AUC在0.795～0.979间,对Ⅰ级和Ⅱ级的AUC在0.651～0.937；7种miRNA在术后患者血清中水平均显著上升（P<0.001）。结论：星形细胞瘤患者血清miRNA表达谱与正常人有较大差异；7种miR-15b*,miR-23a, miR-133a, miR-150*, miR-197, miR-497和miR-548b-5p在患者血清中显著下降,尤其是恶性患者；其中一些miRNA可以将增生、良性与恶性星形细胞瘤明确区分开来；而术后这7种miRNA显著上升；7种miRNA的组合可作为星形细胞瘤潜在的生物标志物,具有诊断、分级和预后判断价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 miRNA的研究背景
• 1.1.1 miRNA的定义及发现历程
• 1.1.2 miRNA的形成过程
• 1.1.3 miRNA的生物学意义
• 1.1.4 miRNA的研究手段
• 1.1.5 miRNA与肿瘤的关系
• 1.2 miRNA在星形细胞瘤组织中的研究概况
• 1.2.3 miRNA在星形细胞瘤检测、诊断和治疗上的潜在临床意义
• 1.3 循环miRNA及其作为肿瘤生物标志物的研究概述
• 1.3.1 血清/血浆中稳定存在miRNA
• 1.3.2 血清/血浆miRNA的特性
• 1.3.3 血清/血浆miRNA作为肿瘤分子标志物
• 1.3.4 血清/血浆miRNA的来源及高稳定性的机制
• 1.3.5 血清/血浆miRNA作为一种肿瘤标志物的临床意义
• 第2章 星形细胞瘤患者血清miRNA的Solexa测序
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 研究对象和样本收集
• 2.1.2 仪器与试剂
• 2.1.3 血清RNA提取方法（用于Solexa测序）
• 2.1.4 Solexa测序
• 2.2. 实验结果
• 2.2.1 血清RNA提取的结果
• 2.2.2 Solexa测序结果
• 2.2.3 星形细胞瘤患者血清miRNA表达与正常对照差异
• 2.3 讨论
• 第3章 星形细胞瘤患者特异血清miRNA的筛选及验证
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 研究对象和样品收集
• 3.1.2 仪器与试剂
• 3.1.3 方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 星形细胞瘤患者特异血清miRNA的复筛
• 3.2.2 星形细胞瘤患者特异血清miRNA的验证
• 3.2.3 不同级别星形细胞瘤患者特异血清miRNA表达的验证
• 3.2.4 聚类分析
• 3.2.5 星形细胞瘤患者特异血清miRNA的ROC曲线分析
• 3.2.6 恶性星形细胞瘤术前和术后血清miRNA表达差异
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢