二苯乙烯苷通过调节ROS-NO通路保护6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡

论文摘要

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的神经系统退行性疾病。其主要病理特点为黒质致密部（Substantia nigra pars compact, SNpc）含黑素的多巴胺（Dopamine,DA）能神经元选择性变性缺失,主要临床特点为静止震颤,肌僵直,姿态不稳以及运动缓慢。目前,PD的病因和发病机制尚不明确。但大量研究已经表明氧化应激和线粒体功能障碍与PD的发病机制密切相关。6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）是DA的一种羟化衍生物,广泛的用于PD体内外模型的建立。其具有神经毒性并且能够诱导体内外DA能神经元的凋亡。PC12细胞株来源于大鼠嗜铬细胞瘤,它具有类似于多巴胺合成、代谢和转运系统的功能,与中脑多巴胺能神经元特性十分接近。二苯乙烯苷（2,3,5,4-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG）是从中草药何首乌中提取的有效活性成分之一。其具有抗氧化,抗炎,以及改善学习记忆的作用。有研究已经证实TSG可改善老年痴呆小鼠的学习记忆能力,具有神经保护作用。最近,我们的研究表明TSG对MPP+诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用。为了进一步研究TSG的神经保护作用,本研究选择与DA能神经元特性相似的PC12细胞和具有神经毒素的6-OHDA建立体外PD模型,观察TSG对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡是否有保护作用,并对其作用机制做初步探讨。【目的】1.用神经诱导因子处理细胞使之具有类似DA的性能。2.建立PD体外模型,筛选出6-OHDA诱导PC12细胞凋亡的有效浓度和TSG对6-OHDA诱导PC12细胞凋亡的有效保护浓度;3.观察TSG对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡的影响;4.研究TSG减轻6-OHDA诱导PC12细胞凋亡可能的机制。【方法】1.设立空白对照组,25,75,100,125,150,200和300μmol/L6-OHDA浓度组作用于PC12细胞24h,筛选6-OHDA实验处理有效浓度,筛选出6-OHDA有效浓度为75μmol/L;设立空白对照组,1,5,10,20,50,100,200μmol/LTSG浓度组作用PC12细胞24h,观察TSG单独处理细胞对细胞的影响;设立空白对照组,1,5,10,20,50,100,200μmol/L TSG浓度组作用PC12细胞24h,再用6-OHDA（75μmol/L）处理24h,筛选TSG实验处理有效浓度,筛选出最佳TSG预处理组浓度为10,20,50μmol/L。2.设立正常对照组,单独TSG处理组,6-OHDA处理组,不同浓度TSG预处理组（10,20,50μmol/L）,用MTT比色法检测细胞活力;Hoechst33258染色观察细胞核形态变化;流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡百分率;TUNEL染色观察细胞DNA断裂情况;3.通过全自动荧光酶标仪检测细胞内ROS和NO水平;4.通过Elisa检测试剂盒检测3-NT蛋白水平;5.通过Western Blot法检测细胞中iNOS和nNOS蛋白的表达水平;【结果】1. MTT比色法检测观察,与对照组相比,75μmol/L6-OHDA处理PC12细胞24h后细胞活力为（52.6±1.3）%（P<0.01）。TSG预处理细胞24h后,再用75μmol/L 6-OHDA处理24h,与6-OHDA组（52.6±1.3）%相比,10,20,50μmol/LTSG预处理组细胞活力分别上升为（66.6±3.2）%（P<0.01）,（73.0±1.6）（P<O.01）和（83.9±1.5）%（P<0.01）。单独不同浓度TSG（1,5,10,20和50μmol/L）对细胞活力无明显影响;但是高浓度TSG（100,200μmol/L）对细胞活力有抑制趋势。2. Hoechst33258染色观察到,正常细胞核显示蓝色,均匀淡染,边缘光滑整齐,6-OHDA处理组细胞核呈致密浓染,细胞染色质皱缩,显示亮蓝荧光,甚至可见细胞核断裂,呈现致密的颗粒荧光。而用TSG（10,20和50μmol/L）预处理细胞后,上述细胞凋亡特点明显改善。单独TSG处理组对细胞形态学无明显影响。3. FCM结果显示,正常组,仅TSG组,6-OHDA处理组,TSG（ 10,20和50μmol/L）预处理组凋亡细胞百分率分别为1.8%,1.6%,35.2%,30.7%和18.7%,13.6%。4. TUNEL染色显示,与正常对照组（4.8±1.4）%相比,6-OHDA组TUNEL阳性细胞数增加到（30.6±2.0）%（P<0.01）,而TSG（10,20和50μmol/L）组TUNEL阳性细胞数则分别下降为（22.8±1.0）%（P<0.01）,（19.4±0.9）（P<0.01）和（11.6±1.1）%（P<0.01）。仅TSG组对细胞形态无明显影响。5.全自动荧光酶标仪检测ROS和NO观察到,与正常对照组细胞内ROS水平（99.8±3.1）%相比,6-OHDA组细胞内ROS水平增加到（178.4±9.4）%（P<0.01）,而TSG（10,20和50μmol/L）预处理组细胞内ROS水平则分别下降为（169.6±8.8）%,（156.0±9.1）%（P<0.01）,（119.2±7.4）%（P<0.01）;仅TSG组对细胞内ROS影响不明显。与正常对照组细胞内NO水平（98.8±4.1）%相比,6-OHDA组细胞内NO水平增加到（308.6±23.6）%（P<0.01）,而TSG（10,20和50μmol/L）预处理组细胞内NO水平则分别下降为（287.6±23.2）%,（236.0±34.8）%,（158.0±14.6）%（P<0.01）,仅TSG处理对细胞内NO影响不明显。6. Elisa检测试剂盒检测3-NT显示,与正常对照组细胞内3-NT水平（4.4±0.3）%相比,6-OHDA组细胞内3-NT水平增加到（18.2±0.8）%（P<0.01）,而TSG（10,20和50μmol/L）预处理组细胞内3-NT水平则分别下降为（16.7±0.9）%,（14.6±1.3）%（P<0.05）,（10.1±0.7）%（P<0.01）,仅TSG处理对细胞内3-NT影响不明显。7. Western Blot方法检测结果表明,TSG（10,20和50μmol/L）预处理组iNOS和nNOS表达水平较6-OHDA处理组明显依次减弱。【结论】1.在一定浓度范围内,TSG以剂量依赖的方式能够减轻6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡。2. TSG减轻6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡与调节ROS-NO通路有关。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾一
• PD 流行病学的研究
• PD 病因机制的研究
• 文献回顾二
• 中医病因病机
• 实验一 TSG 对6-OHDA 诱导的PC12 细胞凋亡的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 TSG 减轻6-OHDA 诱导的PC12 细胞凋亡的作用机制探讨
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢