孕期及哺乳期低剂量三丁基锡暴露对子代小鼠生殖、内分泌系统的影响

论文摘要

有机锡化合物（Organo-tin Compounds）是锡元素和碳元素直接结合所形成的金属有机化合物。通式RnSnX4n（n=1-4,R为烷基或芳香基）,主要有烷基锡化合物和芳香基锡化合物两类。有机锡化合物被广泛用于催化剂、稳定剂、农用杀虫剂、杀菌剂以及日常用品的涂料和防霉剂等。由于使用广泛,有机锡类化合物已对全球环境（尤其是水体环境）造成了严重污染。有机锡化合物可经呼吸道、消化道和皮肤吸收。三丁基锡（Tributyltin, TBT）是有机锡化合物中重要的一种,已有的研究显示TBT对哺乳动物可产生免疫毒性、神经毒性、生殖毒性等。目前关于低剂量有机锡化合物暴露的影响研究很少,尤其对子代的影响研究较少,本实验通过对孕期及哺乳期低剂量TBT暴露的孕鼠及其两代仔鼠的生长发育的观察及早期神经行为学和生化指标的测量,研究了TBT对两代仔鼠生殖、内分泌系统的影响。目的研究孕期及哺乳期低剂量TBT暴露对两代子鼠生长发育、早期神经行为和生殖及内分泌系统的影响,以评估孕期及哺乳期低剂量三丁基锡暴露对人类后代可能产生的影响。方-法1.实验动物处理将清洁级健康妊娠KM小鼠随机分为100、10、11μg/kg TBT染毒组和阴性对照组（玉米油）,每组6只。从妊娠第6天（GD6）起,采用经口灌胃方式进行染毒,每天1次,直至哺乳期结束,灌胃剂量按照每天称量的体重计算。F1代子鼠饲养90天,同一剂量组内交叉配种。仔鼠在出生后第21天（PND21）断奶。2.子代行为学指标的观察与记录仔鼠出生后记录仔鼠数量、雌雄数量及体重,观察有无畸形及死亡情况。仔鼠出生后第1天（PND1）、3、5、7、14、21天时称量仔鼠体重,PND12开始观察仔鼠睁眼情况,PND20开始观察阴道张开情况,PND21开始观察雌鼠初潮情况。从PND28开始观察包皮分离情况。仔鼠断奶后每周称量一次体重,计算体重增加量。PNDs3、5、7、9、14测量仔鼠翻正时间（Righting Reflex）和悬崖憎恶反应时间（Cliff-drop Aversion Reflex）, PNDsl2、14测量仔鼠前肢握力实验时间,PNDs12、14测量仔鼠垂直网试验时间,PNDs3、5、7、9、14测量仔鼠负趋地性反射时间,从出生后第8天开始观察仔鼠听觉惊愕反射,并记录出现听觉惊愕反射阳性时的日龄。3.组织中生物标志物的测定PND49时各剂量组随机抽取雌雄各10只仔鼠,取脑,胸腺、睾丸、附睾或子宫、卵巢,称重并计算脏器系数。雄性小鼠观察精子活力、精子计数和精子畸形率等指标,应用流式细胞术（FCM）分析Fl代小鼠精子质膜完整性及精子染色质状态。应用Western-blotting技术分析雄鼠睾丸和雌鼠卵巢中雌激素受体α（ER-α）及雌激素受体p（ER-β）蛋白的表达,及下丘脑中芳香酶蛋白的表达。结果本实验结果显示,TBT对F0孕鼠具有毒性作用：10μg/kg和100μ/kg剂量组母鼠孕期体重增加量与对照组相比显著降低（P<0.05）。TBT对F1孕鼠的毒性作用不明显,各剂量组母鼠孕期体重增加量与对照组相比无显著性差异。TBT对妊娠结果的影响：FO代和F1代各染毒组母鼠产仔数量、仔鼠哺乳期死亡率和仔鼠雌雄比例与对照组相比均无显著差异（P>0.05）。1.实验动物行为学的改变TBT染毒导致F1仔鼠的早期神经行为发育迟缓,100μg/kg剂量组在PND7时及10μg/kg和100μg/kg剂量组在PND5时翻正反射时间比对照组显著延迟（P<0.05）,各染毒组在PND3及PND5时的悬崖憎恶反应时间与对照组相比显著延迟（P<0.05）,100μg/kg剂量组前肢握力时间及垂直网试验时间均明显缩短（P<0.05）。各染毒组在PND6时及10μg/kg和100μg/kg剂量组在PND9时的负趋地性反射时间与对照组相比显著延迟（P<0.05）,各染毒组出现听觉惊愕反射阳性时的日龄与对照组相比显著延迟（P<0.05）。2.实验动物发育指标及生物标志物的改变F1代雄性小鼠各染毒组精子畸形率与对照组相比显著升高（P<0.05,P<0.01）；各染毒组包皮分离时间与对照组相比显著延迟（P<0.05）；各染毒组精子计数有减少的趋势,应用流式细胞术（FCM）分析表明F1代雄鼠附睾中精子质膜形态及染色质结构也发生了显著变化；F2代10μg/kg剂量组仔鼠包皮分离时间与对照组相比显著延迟（P<0.05）；各染毒组仔鼠精子计数与精子畸形率与对照组相比无显著差异（P>0.05）。Western-blotting分析显示,雌激素受体（ER-α和ER-β）蛋白和芳香酶蛋白在睾丸和卵巢内的表达均是随着TBT浓度升高逐渐减弱,并呈剂量-效应性关系。结论1、孕期及哺乳期低剂量的TBT暴露可产生母体毒性,使孕鼠体重增加量降低。并影响子代小鼠的生长发育,对子代小鼠产生内分泌干扰作用,可以使F1代雌性小鼠性早熟、F1代雄性小鼠性发育迟缓。2、孕期及哺乳期低剂量的TBT暴露可导致F1仔鼠的早期神经行为发育迟缓,这可能是TBT作为内分泌干扰物对仔鼠内分泌干扰及TBT的神经毒性共同作用的结果。3、孕期及哺乳期低剂量的TBT暴露影响了子代小鼠精子发生,精子质量、并对F1雄鼠附睾中精子质膜形态及染色质结构产生影响。4、孕期及哺乳期低剂量的TBT暴露使雌激素受体（ER-α和ER-β）在子代睾丸或卵巢组织内的表达及芳香化酶蛋白在脑、睾丸或卵巢组织内的表达水平降低。5、孕期及哺乳期低剂量的TBT暴露导致子代小鼠生长发育迟缓、精子质量下降、早期神经行为发育迟缓,这可能是由于TBT抑制了雌激素合成关键酶及雌激素受体。

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