高产纤维素酶嗜热真菌的和选育及其分子特性分析

论文摘要

纤维素是世界上储量最丰富的可再生资源。纤维素酶是一类可以协同降解纤维素为葡萄糖的几种酶的总称,现已被广泛应用于食品、生物能源、纺织、饲料等多个行业中。许多昆虫和植物都能生产纤维素酶,但实际生产中的纤维素酶几乎都来自于微生物,而利用真菌产纤维素酶主要具有易培养、酶系全、产量高、易提取的优点。嗜热真菌所分泌的纤维素酶由于其良好的耐热性能而有着更好的应用前景,因此筛选出产纤维素酶嗜热真菌具有重要的研究意义和实践价值。由于直接从自然界中分离纯化出的产纤维素酶真菌存在着酶活低、产酶少等问题,因此需要利用诱变以及分子生物学技术对菌种进行改造,以期能进一步选育出高产纤维素酶嗜热真菌。本文以此为目的,实验结果总结如下：（1）通过刚果红染色法与酶活测定法从福建永泰温泉中筛出了3株产纤维素酶嗜热真菌M40-1、M40-2、M40-3。经ITS rDNA序列分析,三株菌株均归属于Aspergillus fumigatus。其中纤维素酶产量最高的菌株M40-1的最适产酶条件为：发酵时间48h、温度40℃、pH值5.0,其CMC酶活为5.64 U/ml,p-葡萄糖苷酶活为4.31 U/ml。（2）以本实验室保存的产纤维素酶嗜热真菌YT-40（Candida parapsilosis）及其正突变体作为目标菌株,建立了YT-40的原生质体制备、再生与融合的方法：通过富集培养基收集YT-40菌体,经3mg/ml纤维素酶与3mg/ml蜗牛酶协同酶解1h后,原生质体制备率可达到75%以上。得到的原生质体经纯化后涂布于优化后的再生培养基上,原生质体的再生比率可达80%以上。将YT..40正突变体原生质体作为亲本,于35℃,35% PEG-6000、0.01M CaCl2的条件下进行原生质体融合。（3）通过对出发菌株YT-40及其等离子体分别进行等离子诱变、紫外联合氯化锂诱变、硫酸二乙酯诱变以及复合诱变,共筛出了8株单诱变正突变体,CMC酶活较出发菌株提高了76.56%～122.45%不等；获得了2株复合诱变正突变体,CMC酶活分别提高了156.67%（正常态）、150.64%（原生质体）；将8株单诱变正突变体进行基因组重排,获得了1株高产纤维素酶融合子F14,CMC酶活较出发菌株YT-40提高了176.74%。上述菌株均经过5次传代产酶培养实验,纤维素酶活力稳定,具有较高的遗传稳定性。（4）出发菌株YT-40最适产CMC酶条件为：发酵时间24h、温度40℃、pH值6.0,经优化后的CMC酶活为6.27 U/ml；融合子F14最适产CMC酶条件为：发酵时间24h、温度45℃、pH值5.0,经优化后的CMC酶活为16.70 U/ml。（5）利用SDS-PAGE技术与RAPD技术研究比较了融合子F14与出发菌株YT-40的分子特性差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 纤维素的研究进展
• 1.1.1 纤维素的结构
• 1.1.2 纤维素的降解
• 1.2 纤维素酶研究进展
• 1.2.1 纤维素酶的分类
• 1.2.2 纤维素酶分子结构
• 1.2.3 纤维素酶作用机理
• 1.2.4 纤维素酶的应用
• 1.2.5 纤维素酶的来源
• 1.3 产纤维素酶微生物选育研究进展
• 1.3.1 常规理化诱变技术育种
• 1.3.2 分子生物学技术育种
• 1.4 本研究的目的意义和内容
• 第二章 产纤维素酶嗜热真菌的筛选鉴定及其液体产酶条件优化
• 2.1 实验材料及仪器
• 2.1.1 培养基
• 2.1.2 实验菌株及试剂
• 2.1.3 常用溶液配制
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品采集及处理
• 2.2.2 产纤维素酶嗜热真菌的分离纯化
• 2.2.3 产纤维素酶嗜热真菌的筛选
• 2.2.4 产纤维素酶嗜热真菌的复筛
• 2.2.5 产纤维素酶嗜热真菌的分子鉴定
• 2.2.6 产纤维素酶嗜热真菌液体产酶条件优化
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 纤维素降解嗜热菌初筛结果
• 2.3.2 纤维素降解嗜热菌复筛结果
• 2.3.3 产纤维素酶嗜热真菌分子鉴定
• 2.3.4 产纤维素酶嗜热真菌液体产酶条件优化
• 2.4 小结
• 第三章 产纤维素酶嗜热真菌YT-40选育
• 3.1 实验材料及仪器
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 实验试剂
• 3.1.4 常用溶液配制
• 3.1.5 仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 产纤维素酶嗜热真菌YT-40诱变选育
• 3.2.2 产纤维素酶嗜热真菌YT-40原生质体制备
• 3.2.3 产纤维素酶嗜热真菌YT-40原生质体检测
• 3.2.4 产纤维素酶嗜热真菌YT-40原生质体诱变选育
• 3.2.5 利用基因组重排技术选育高产纤维素酶嗜热真菌
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 产纤维素酶嗜热真菌YT-40等离子体诱变结果
• 3.3.2 产纤维素酶嗜热真菌YT-40紫外联合氯化锂诱变结果
• 3.3.3 产纤维素酶嗜热真菌YT-40硫酸二乙酯诱变结果
• 3.3.4 产纤维素酶嗜热真菌YT-40复合诱变结果
• 3.3.5 产纤维素酶嗜热真菌YT-40原生质体制备条件优化
• 3.3.6 产纤维素酶嗜热真菌YT-40原生质体紫外联合氯化锂诱变结果
• 3.3.7 产纤维素酶嗜热真菌YT-40原生质体硫酸二乙酯诱变结果
• 3.3.8 等离子诱变正突变菌株原生质体复合诱变结果
• 3.3.9 利用基因组重排技术选育高产纤维素酶嗜热真菌
• 3.4 小结
• 3.5 讨论
• 第四章 出发菌株YT-40与融合子F14液体产酶条件优化与分子特性分析
• 4.1 实验材料及仪器
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 实验试剂
• 4.1.4 常用溶液配制
• 4.1.5 仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 出发菌株YT-40与融合子F14液体产酶时间优化比较
• 4.2.2 出发菌株YT-40与融合子F14液体产酶温度优化比较
• 4.2.4 出发菌株YT-40与融合子F14的SDS-PAGE分析
• 4.2.5 出发菌株YT-40与融合子F14的RAPD分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 发酵时间对出发菌株YT-40与融合子F14产酶的影响
• 4.3.2 培养温度对出发菌株YT-40与融合子F14产酶的影响
• 4.3.3 pH对出发菌株YT-40与融合子F14产酶的影响
• 4.3.4 出发菌株YT-40与融合子F14的差异蛋白分析
• 4.3.5 出发菌株YT-40与融合子F14的基因组RAPD扩增分析
• 4.4 小结
• 4.5 讨论
• 第五章 总结与展望
• 5.1 全文总结
• 5.2 本文存在的问题及深入方向
• 参考文献
• 附录
• 致谢