金龟子绿僵菌耐夏季高温能力的种内变异、一新孢壁蛋白的基因克隆及功能鉴定

论文摘要

作为真菌杀虫剂的有效成份,金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）的气生分生孢子很容易在诸如稻米、大麦等谷物固体基质上大量生产,并配制成适当剂型用于害虫防治。分生孢子对环境胁迫的耐受力决定了其制剂的贮存稳定性和田间持效性,而夏季高温就是最重要的胁迫因子之一。建立定量合理、结果可靠、简便易行的定量评价体系,是筛选耐夏季高温生产菌株的重要基础。另一方面,孢壁是由多种蛋白质、几丁质和多糖类物质组成的孢子保护结构,尤其众多孢壁蛋白的功能,目前可知者寥寥。为此,作者研究建立了生防真菌耐夏季高温能力的定量评价体系,并应用于不同寄主和地理来源的18株绿僵菌分生孢子的耐热力比较测定;在此基础上对18株金龟子绿僵菌的甲酸可抽提的孢壁蛋白进行了比较分析,从中发现了一条9.9 kDa的全新孢壁蛋白,并成功地进行了基因克隆和功能鉴定。主要研究内容和结果分述如下:金龟子绿僵菌耐夏季高温能力的种内变异对不同寄主和地理来源的18株绿僵菌,包括8株变种未知的金龟子绿僵菌（M.anisopliae;用Ma表示）、4株金龟子变种（M.anisopliae var.anisopliae;Maan）和6株蝗变种（M.anisopliae var.acridum;Maac）,进行了48℃热胁迫实验和10-35℃下的菌落生长数率的测定。首先,用稻米基质上生产的孢子粉配制成孢子悬液,于玻璃试管中在48℃下水浴胁迫,每隔15 min从试管中取样涂板,培养24 h并测定残存活孢率,直至活孢率等于或接近于零为止。用供试菌株相对于对照的残存指数拟合衰变模型（0.975≤r2≤0.999）,再用拟合的模型参数计算各菌株的半致死时间(LT50),作为其耐受48℃热胁迫能力的定量指标。所获LT50在供试菌株中差异很大,源于非洲蝗虫7株菌的LT50平均高达110（73-150）min,但在10和15℃下不能形成平板菌落;源于其他寄主的5个菌株在10-35℃下都能生长良好,但平均LT50仅16（10-26）min。根据供试菌株的LT50,选出对48℃热胁迫耐受能力强、中、弱的三个典型菌株,分别对其进行38、40、42和45℃下的耐热力测定,其中38℃下的测定时间长达4天。结果显示,随着胁迫温度的升高,LT50呈下降趋势。耐热力强、中、弱三株菌的LT50从38℃下的8256、1612和507 min分别降至48℃下的167、53和20 min。三株典型菌株的LT50与供试5个胁迫温度均存在显著的逆相关（0.881≤r2≤0.980）。由此,准确高效筛选用于害虫防治的耐夏季高温的优良菌株,最佳胁迫温度是45-48℃,胁迫实验的时间在6 h以内。金龟子绿僵菌孢壁蛋白抽提与组分分析用甲酸法抽提18株供试真菌分生孢子的孢壁蛋白,抽提物中孢壁蛋白的含量在不同菌株间差异极显著(F17,36=267.0,P＜0.01),最高的菌株Ma 2421为50.2±1.2μg/mg孢子,而一株蝗变种菌株Maac 6421仅有3.4±0.5μg/mg。种内不同变种间的比较显示,8株金龟子绿僵菌的平均含量为28.4±12.3μg/mg,4株金龟子变种的平均含量为27.3±15.1μg/mg,均显著高于6株蝗变种的平均含量14.7±8.4μg/mg。此外,变种内不同菌株间的孢壁蛋白含量也差异极显著(Ma:F7,16=212.9,P＜0.01;Maac:F5,12=263.2,P＜0.01;Maan:F3,8=238.2,P＜0.01)。对不同菌株孢壁蛋白的组分进行SDS-PAGE电泳分析,发现多条条带,分子量9.0-90 kDa不等,菌株间孢壁蛋白组分差异极大;仅蛋白含量最低的Maac 6421菌株无可分辩条带。一条约9.9 kDa的条带为多个供试菌株共有,命名为CWP10,作为目标蛋白进行深入研究。一种新孢壁蛋白CWP10的基因克隆与功能鉴定将供试菌株分生孢子甲酸抽提物的SDS-PAGE分析中最显著的菌株Maan 4132蛋白条带CWP10进行分离纯化,通过N端测序和DNA扩增,获得了该蛋白的全长基因CWP10,总长为535 bp（GenBank accessionnumber:FJ548848）,其中开放阅读框（ORF）为363 bp,含有三个大小分别为57、63和52bp的内含子,将编码区分隔成四个外显子。Southern杂交显示,CWP10在绿僵菌基因组中呈单拷贝。编码区翻译一条由120个氨基酸组成的蛋白肽段,DNAstar分析显示其分子量为13.3 kDa,等电点为7.49。该基因及其编码的蛋白在GenBank和Swiss-Prot数据库中没有找到任何同源序列,因而是一全新的基因和蛋白。对照翻译后的氨基酸序列和蛋白N端测序结果,CWP10应是一种分泌型蛋白,在其N端一条32个氨基酸的信号肽被切除后,成为一个9.9 kDa的成熟蛋白。经疏水性预测分析和糖基化染色检测,CWP10并无疏水特征,也非糖基化蛋白。其N端信号肽结构包含一个约10个残基的疏水核心,并以4个极性氨基酸（QYYT）作为C端结尾。用胶体金标记定位CWP10,发现其大量分布于孢壁内层,而在孢壁外层及细胞质中分布较少。用CWP10的多克隆抗体对18株供试菌进行Western杂交检测,结果在7株的分生孢子中检测到该蛋白的存在。将来自Maan 4132的新孢壁蛋白基因CWP10,通过芽生孢子转化体系转入无此孢壁蛋白的球孢白僵菌（Beuaveria bassiana）的野生菌株BbW中,所获转化子BbT的分生孢子的疏水性被显著提高10.5%,对聚苯乙烯疏水介质的附着力提高55.2%。但是,与野生菌株相比,转化子的分生孢子对48℃热胁迫和7.0 J/cm2的UV-A辐射剂量及0.7 J/cm2的UV-B辐射剂量的耐受能力,都无显著改变。这是关于生防真菌非疏水、非糖基化的孢壁蛋白能提高孢子疏水性的首次发现。综上所述,本研究的主要成果和创新点,一是研究建立了生防真菌分生孢子耐夏季高温能力的定量评价体系,有助于分类筛选用于害虫生物防治的菌株;二是完成了全新孢壁蛋白CWP10的基因克隆及功能鉴定。这些结果有助于增进对丝孢类生防真菌抗逆性状的研究和对其生物学认识的深化。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 生防真菌的生态适应性及其孢壁蛋白功能的研究现状
• 1.1 生防真菌的生态适应性
• 1.1.1 生防真菌及其制剂的环境胁迫
• 1.1.2 提高生防真菌及其制剂生态适应性的策略
• 1.2 生防真菌孢壁蛋白的结构和功能
• 1.2.1 孢壁组成
• 1.2.2 真菌孢子的疏水蛋白与疏水性
• 1.2.3 其他孢壁蛋白
• 1.3 生防真菌的生物学性状研究及遗传改良方法
• 1.3.1 生防真菌的耐热测定体系
• 1.3.2 胶体金免疫定位技术
• 1.3.3 真菌的遗传转化
• 1.4 研究目标和意义
• 2 金龟子绿僵菌分生孢子耐夏季高温能力的种内变异
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 分生孢子的制备
• 2.1.3 分生孢子耐热力测定
• 2.1.4 菌落生长速率测定
• 2.1.5 数据分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 供试菌株的耐热力
• 2.2.2 不同胁迫温度下的耐热力
• 2.2.3 菌落生长速率
• 2.3 讨论
• 3 金龟子绿僵菌孢壁蛋白的提取与电泳分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 孢壁蛋白提取与含量测定
• 3.1.3 孢壁蛋白的电泳分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 不同菌株的孢壁蛋白含量
• 3.2.2 不同菌株孢壁蛋白的组分分析
• 4 金龟子绿僵菌孢壁蛋白CWP10的基因克隆及分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 质粒
• 4.1.3 试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 目标蛋白分离
• 4.2.2 目标蛋白的电转印
• 4.2.3 目标蛋白的N-端序列测定
• 4.2.4 目标蛋白编码序列的克隆
• 4.2.5 Southern杂交分析
• 4.2.6 原核表达以及抗体制备
• 4.2.7 Western杂交分析
• 4.2.8 目标基因上游疑似启动子序列的克隆及初步分析
• 4.2.9 糖基化染色
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 目标蛋白的N-端序列
• 4.3.2 目标蛋白的基因克隆与序列分析
• 4.4 讨论
• 5 孢壁蛋白CWP10的免疫定位与功能分析
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 质粒
• 5.2 方法
• 5.2.1 胶体金免疫定位
• 5.2.2 转基因菌株的构建
• 5.2.3 转基因菌株的三类孢子疏水率测定
• 5.2.4 转基因菌株的三类孢子对不同介质附着力的测定
• 5.2.5 转基因菌株分生孢子对热胁迫和紫外辐射耐受力的测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 胶体金免疫定位
• 5.3.2 CWP10在球孢白僵菌中的表达
• 5.3.3 孢壁蛋白CWP10对球孢白僵菌疏水性和孢子附着力的影响
• 5.3.4 表达CWP10的球孢白僵菌分生孢子对环境胁迫的反应
• 5.4 讨论
• 6 结语
• 参考文献
• Summary
• 附录:在读期间主要成果