鸡ES单细胞培养与SSCs介导转座子-GFP的研究

论文摘要

胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ES）是一种全能干细胞,能在体外进行培养、传代,并在一定条件下保持未分化的二倍体状态及其全能性,具有形成嵌合体、显示生命活动的能力。单细胞克隆系由于其来源于同一个祖先细胞,所以同源性强,无遗传差异,生物学性状均一,细胞系稳定。可为禽类胚胎干细胞的遗传操作提供遗传背景相同的细胞系。本研究利用鸡第Ⅹ期的胚胎干细胞,采用口吸管法、细胞稀释法和克隆环法三种不同的方法,将细胞集落分离成单个细胞,并接种至96孔板,每孔内接种1个细胞,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物。进行单细胞克隆制备方法的比较,结果显示,口吸管法克隆形成率为0,克隆环法克隆形成率为1%,细胞稀释法克隆形成率为4.2%。经碱性磷酸酶（AKP）活性和阶段特异性表面抗原-1（Stage specific embryonic antigen-1,SSEA-1）免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖不分化。结果表明,细胞稀释法操作简单易行,实验时间短,对细胞伤害小,为鸡ES单细胞克隆进一步建系提供切实可行的方法。“睡美人”转座子（Sleeping Beauty ,SB,transposon）是TC1/mariner转座因子超家族中的一员,是目前在脊椎动物中转座活性最高的转座子。本文以pEGFP-N1和PT2/BH载体质粒为材料,将报告基因EGFP插入到PT2/BH载体质粒中构建重组载体PT-EGFP。PT-EGFP经PCR、酶切鉴定验证构建正确后,提取并纯化重组质粒。转染COS-Ⅰ细胞,荧光显微镜下观察GFP的表达。采用PT-EGFP与“睡美人”转座子系统转染鸡精原干细胞,探讨不同浓度转座子促进外源基因整合效率,将SB与PT-EGFP之比分为0:1、1:3、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25六个梯度,通过电穿孔法染转染鸡精原干细胞。试验结果显示转染原代SB与PT-EGFP的比为1:5、1:10、1:15的荧光表达率最高,分别为23.23%、24.25%、22.51%;传一代后SB与PT-EGFP的比为1:5、1:10荧光表达率最高,分别为4.67%、4.66%;传二代后SB与PT-EGFP的比为1:5、1:10、1:15的荧光表达率,分别为0.94%、1.08%、0.94%。以上结果表明SB具有促进载体质粒表达及基因整合的作用,其中SB与PT-EGFP的比为1:5、1:10、1:15的效率最高。提取转染后第二代细胞DNA,PCR检测结果为阳性。这为进一步将“睡美人”转座子应用于转基因鸡奠定了坚定的基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 一、胚胎干细胞的研究历史及现状
• 1 鸡胚胎干细胞的离体培养
• 1.1 鸡的生理特点
• 1.2 胚胎干细胞的分离和培养
• 1.3 鸡胚胎干细胞的离体培养体系
• 2 胚胎干细胞的鉴定
• 2.1 形态学鉴定
• 2.2 AKP 活性鉴定
• 2.3 SSEAs 检测
• 2.4 分化试验
• 2.5 嵌合体试验
• 2.6 ES 细胞的定向分化潜能
• 3 胚胎干细胞的应用
• 3.1 基础研究
• 3.2 生产克隆动物
• 3.3 生产药物蛋白
• 3.4 生产转基因鸡
• 3.5 品种改良
• 二、“睡美人”转座子系统研究进展
• 1 “睡美人”的分子重建
• 1.1 重建对象的选择
• 1.2 “睡美人”转座酶基因的重建
• 1.3 “睡美人”转座酶的特异识别序列
• 2 SB 转座系统的结构
• 2.1 转座酶基因
• 2.2 反向重复序列
• 3 转座的机制
• 4 “睡美人”转座酶的应用前景
• 4.1 用作转基因载体
• 4.2 基因治疗
• 4.3 新基因的发现
• 5 SB 转座子的检测
• 6 报告基因
• 三、本研究的目的和意义
• 第二章 实验部分
• 实验一 鸡胚胎干细胞单细胞克隆的制备
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 饲养层的制备
• 1.4 鸡Ⅹ期胚盘细胞的分离和培养
• 1.5 鸡ES 单细胞克隆制备
• 1.6 鸡ES 细胞单细胞克隆的鉴定和计算
• 2 实验结果
• 2.1 单细胞克隆的制备
• 2.2 鸡 ES 细胞单细胞克隆的鉴定结果
• 3 讨论
• 实验二 PT-EGFP 质粒的构建以及PT-EGFP 和SB 系统转精原干细胞
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 碱裂解法大量制备质粒DNA
• 1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 1.6 载体DNA 和EGFP 质粒的限制性内切酶消化、电泳及回收
• 1.7 载体与目的片段的连接
• 1.8 连接产物的转化
• 1.9 表达载体的鉴定
• 1.10 饲养层的制备
• 1.11 鸡胚 SSCs 分离、培养和传代
• 1.12 电穿孔法转染 SSCs
• 1.13 转染后的鸡胚SSCs 的培养传代
• 1.14 转染率的观察与计算
• 1.15 数据处理
• 1.16 转染后第二代细胞的PCR 检测
• 2 结果
• 2.1 质粒构建
• 2.2 PT-EGFP 和 SB 系统转精源干细胞
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文目录
• 致谢