论文摘要
目的：黑色素瘤（Melanoma）是一种起源于黑色素细胞的恶性肿瘤,因其恶性程度高,预后差而对人类健康构成极大威胁。本病的发生、发展及转归与机体的免疫系统关系密切。巨噬细胞是机体天然免疫的重要执行者之一,在抗肿瘤免疫中既是抗原提呈细胞,也是杀伤肿瘤的效应细胞。其杀伤机制除了与肿瘤细胞结合,通过释放溶酶体酶直接杀伤肿瘤细胞外,还可以处理和提呈肿瘤抗原、分泌细胞因子等间接杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞也可以通过多种方式逃避机体免疫系统的攻击,抑制机体免疫功能的发挥,其分泌的多种免疫抑制分子对淋巴细胞、巨噬细胞、LAK细胞及NK细胞等免疫效应细胞均有抑制作用。灵芝多糖（Ganoderma lucidum Polysaccharides, Gl-PS）是植物灵芝的主要活性成分之一。灵芝多糖可以活化巨噬细胞,增加巨噬细胞一氧化氮（NO）、TNF-α的分泌。但灵芝多糖能否拮抗肿瘤细胞上清对巨噬细胞的抑制作用,尚无专题实验证实。因此,本实验研究B16F10黑色素瘤细胞培养上清液对同基因小鼠腹腔巨噬细胞的免疫功能的抑制作用,以及灵芝多糖拮抗黑色素瘤细胞培养上清对同基因小鼠腹腔巨噬细胞的抑制作用,探讨其机制,为肿瘤的免疫治疗提供理论依据。方法：1.细胞来源：本实验采用的B16F10黑色素瘤细胞是一种来源于C57BL/6j小鼠的高转移性黑色素瘤细胞系；腹腔巨噬细胞为新鲜制备的C57BL/6j小鼠的腹腔巨噬细胞；L929细胞是来源于小鼠的成纤维细胞。2.制备B16F10黑色素瘤细胞培养上清：2×1005/mlB16F10黑色素瘤细胞,接种于50m1培养瓶,每瓶10ml细胞悬液,培养至细胞长满瓶底80%时换液,继续培养8h,收集培养上清,0.22μm滤纸滤菌,分装,-20℃冻存备用。3.实验分组及干预：分为B16F10黑色素瘤细胞培养上清组,B16F10黑色素瘤细胞培养上清加不同浓度灵芝多糖组（0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml）, RPMI-1640培养基对照组。各组均含有相同浓度的细菌脂多糖LPS10μg/ml。4.采用噻唑蓝比色（MTT）方法,检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的腹腔巨噬细胞的抑制作用。5.采用中性红吞噬实验,检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对巨噬细胞吞噬中性红的抑制作用。6.采用Griess方法检测NO的含量,检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对巨噬细胞释放NO的抑制作用。7.采用免疫细胞化学染色方法,观察灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对腹腔巨噬细胞释放TNF-α的抑制作用。8.采用噻唑蓝比色（MTT）方法,通过L929细胞抑制实验,检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对腹腔巨噬细胞释放TNF-α活性的抑制作用。9.采用蛋白印迹（Western-blot）技术,检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对腹腔巨噬细胞细胞释放TNF-α的抑制作用。10.数据统计分析：应用SPSS13.0统计学软件,对结果进行单因素方差分析,p<0.05表示差别有统计学意义。结果：1.B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的同基因小鼠腹腔巨噬细胞的抑制作用：未加灵芝多糖的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组腹腔巨噬细胞活性、吞噬中性红的能力、释放NO水平分别为0.411±0.035、0.596±0.10、4.830±1.384,与对照组的0.861±0.208、1.275±0.102、11.455±0.175相比,均明显降低,经方差分析,各组差异均有统计学意义（p<0.05）; Western-blot及L929细胞增殖抑制实验检测腹腔巨噬细胞TNF-α表达及活性分别为3.221±0.333和0.387±0.030,与对照组的0.84±0.213和0.746±0.049相比,TNF-α的表达均明显降低,经方差分析,各组差异均有统计学意义（P<0.05）；免疫细胞化学染色检测B16F10黑色素瘤细胞培养上清组TNF-α的表达明显降低于RPMI-1640培养基对照组。2.灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的腹腔巨噬细胞的抑制作用：MTT结果显示,在不同浓度灵芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤细胞培养上清作用的LPS诱导24h后的同基因小鼠腹腔巨噬细胞OD值分别为0.439±0.041、0.492±0.037、0.679±0.051、0.818±0.123,结果明显高于未用灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组0.411±0.035,呈一定的剂量依赖关系,但均未能达到RPMI-1640培养液对照组0.861±0.208。经方差分析,差异有显著性（F=21.339,p<0.05）。两两比较除B16F10黑色素瘤细胞培养上清组与0.2μg/ml组、0.8μg/ml组；0.2μg/ml组与0.8μg/ml组;3.2μg/ml组与12.8μg/ml组、RPMI-1640培养液对照组；12.8μg/ml组与RPMI-1640培养液对照组之间比较差异无显著性外,各组之间差异均有显著性（p<0.05）。3.灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的腹腔巨噬细胞吞噬中性红的抑制作用：在不同浓度灵芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤细胞培养上清作用的LPS诱导24h后的同基因小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的OD值分别为0.686±0.056、0.765±0.037、0.778±0.046、0.787±0.057,结果明显高于未用灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组0.596±0.100,呈一定的剂量依赖关系,但均未能达到RPMI-1640培养液对照组1.275±0.102。经方差分析,差异有显著性（F=67.054,p<0.05）。两两比较除B16F10黑色素瘤细胞培养上清组与0.2μg/ml组；0.2μg/ml组与0.8μg/ml组、3.2μg/ml组、12.8μg/ml组；0.8μg/ml组与3.2μg/ml组、12.8μg/ml组;3.2μg/ml组与12.8μg/ml组之间比较差异无显著性外,各组之间差异均有显著性（p<0.05）。4.灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的腹腔巨噬细胞释放NO的抑制作用：在不同浓度灵芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤细胞培养上清作用的LPS诱导24h后的同基因小鼠腹腔巨噬细胞释放NO值分别为5.749±1.109、5.717±1.131、6.081±1.597、8.060±1.375,结果明显高于未用灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组4.830±1.384,但均未能达到RPMI-1640培养液对照组11.455±0.175。经方差分析,差异有显著性（F=12.032,p<0.05）。两两比较B16F10黑色素瘤细胞培养上清组和各不同浓度灵芝多糖组之间差异无显著性,与RPMI-1640培养液对照组之间差异均有显著性（p<0.05）。5.免疫细胞化学染色检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的巨噬细胞释放TNF-a的抑制作用：在不同浓度灵芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导24h后的同基因小鼠腹腔巨噬细胞的抑制作用明显减低,巨噬细胞TNF-a表达增加,免疫细胞化学染色阳性程度明显高于未经灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组,但均低于RPMI-1640培养液对照组。6.L929细胞增殖情况检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的巨噬细胞释放TNF-a的抑制作用：经含有不同浓度灵芝多糖的B16F10黑色素瘤细胞培养上清作用同基因小鼠腹腔巨噬细胞24h后的培养上清作用L929,48h后L929细胞OD值分别为0.600±0.032、0.599±0.084、0.550±0.076、0.496±0.045,结果明显低于未用灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组0.746±0.049,呈一定的剂量依赖关系,但均未能达到RPMI-1640培养液培养的巨噬细胞上清培养组0.387±0.030,各组结果均明显低于RPMI-1640培养液对照组0.897±0.038。经方差分析,差异有显著性（F=57.145,p<0.05）。两两比较除0.2μg/ml组与0.8μg/ml组、3.2μg/ml组；0.8μg/ml组与3.2μg/ml组;3.2μg/ml组与12.8μg/ml组之间比较差异无显著性外,各组之间差异均有显著性p<0.05)。7. Western-blot方法检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的巨噬细胞释放TNF-α的抑制作用：在不同浓度灵芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导24h后的同基因小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α表达的抑制作用明显减低,相对表达量分别为1.068±0.243、1.367±0.138、1.753±0.083、2.006±0.323,明显高于未用灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组0.84±0.21,且呈剂量依赖关系,但均低于RPMI-1640培养液对照组3.221±0.333。经方差分析,差异有显著性（F=38.296,p<0.05）。两两比较除B16F10黑色素瘤细胞培养上清与0.2μg/ml组；0.2μg/ml组与0.8μg/ml组;0.8μg/ml组与3.2μg/ml组；3.2μg/ml组与12.8μg/ml组之间比较差异无显著性外,各组之间差异均有显著性（p<0.05）。结论：1.B16F10黑色素瘤细胞培养上清对同基因小鼠腹腔巨噬细胞有免疫抑制作用。2.灵芝多糖可拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对同基因小鼠腹腔巨噬细胞的免疫抑制作用。
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