论文摘要
β-1,4-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannanmann-ohydrolase ,EC3.2.1.78）,是一类能水解含β-l,4- D-甘露糖糖苷键的内切水解酶,属于半纤维素酶类。目前,国内外有关于筛选产β-甘露聚糖酶菌株的报道大多限于从土壤或水体中分离产的菌株。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来,植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注,有关于植物内生菌的研究最初主要集中于拮抗菌的筛选,近几年更关注于产生物活性物质菌株的分离,但在产酶菌株筛选方面国内外见相关报道很少,本研究尝试在内生菌中筛选产β-甘露聚糖酶的菌株。本研究采用富集培养的方法从富含甘露聚糖的植物组织中分离出46株内生菌菌株,利用刚果红染色法筛进行初筛,选出7株产β-甘露聚糖酶的内生菌菌株。采用摇瓶培养和测定其酶活力方法,复筛出2株产酶能力较高的菌株CH--3和HD-1,其酶活力分别达42 U/mL和54 U/mL,具有较高的研究价值。克隆并测定菌株CH-3的16S rDNA序列,采用BLAST软件在GeneBank进行16S rDNA序列同源性比较,发现CH-3的16S rDNA序列与类芽孢杆菌属细菌（Paenibacillus polymyxa strain YRL13 EU373421）相似度达97%。结合它的形态观察及生理生化试验,初步鉴定CH-3为类芽孢杆菌属细菌Paenibacillus sp（.Genbank登录号为HQ329105）。克隆菌株HD-1的16S rDNA序列进行测定并用采用BLAST软件在GeneBank进行16S rDNA序列同源性比较,发现HD-1的16S rDNA序列与芽孢杆属细菌（Bacillus subtilis EU257435）相似度高达99%。结合其形态观察及生理生化试验,初步鉴定HD-1为芽孢杆属细菌Bacillus sp.（Genbank登录号为HQ329104）。酶学性质的分析发现,菌株CH-3产生的β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别为40℃和5.0-8.0之间;该酶在50℃保温2 h酶活仍保留63 %,pH 5. 0-10. 0条件下保温1 h酶活仍保留66 %以上; Fe2+、Ca2+、Co2+、对该酶有激活作用,其中以Co2+的激活作用最为显著,使酶活提高了23 %;Cu2+、Mn2+、Zn2 +和EDTA对该酶有抑制作用。菌株HD-1产生的β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别为30℃-50℃和7.0;该酶在50℃保温2 h酶活仍保留68 %,pH 5. 0-9. 0条件下保温1 h酶活仍保留64 %以上, Zn2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、K+对该酶有激活作用,其中以Ca2+的激活作用最为显著,使酶活提高了31 %;Mn2+和EDTA对该酶有抑制作用。通过对发酵温度、培养基初始pH值的单因素试验和转速、发酵时间和接种量等的正交试验对HD-1产β-甘露聚糖酶的影响的研究,得到HD-1的最佳培养条件为:培养温度35℃,初始pH值7.0,200 r/min,发酵72 h,接种量为5 %。以摇瓶发酵培养基为基础,对碳源的种类和浓度、氮源的种类、氮源与碳源的比例进行的单因素优化,结果显示,以3%魔芋粉作为碳源,以0.375 % （NH4）2SO4作为氮源有利于HD-1产酶;对发酵培养基中的离子浓度进行正交试验优化,得到最优的离子浓度分别为FeSO4 0.001 %,NaCl 0.5 %,MgSO4 0.01 %。经过培养条件和培养基的优化,HD-1的产酶水平达到98.3 U/mL,约是复筛酶活力的1.8倍。采用优化后的发酵培养基配方和培养条件在50 L发酵罐中进行菌株HD-1产酶的放大试验,从发酵的8 h开始,每隔4 h取样测其酶活力。结果表明,从发酵培养的56 h开始酶活力迅速增加,在64 h达到高峰期,发酵液的最高酶活力达193.12 U/mL,约是菌株复筛酶活力的3.6倍,摇瓶发酵酶活力的2倍。表明采用发酵罐生产更有利于菌株HD-1产酶,这也为以后该菌株的工业化生产打下了基础。