论文摘要
目的胰腺癌是一种恶性程度极其高的肿瘤,具有发现晚、进展快、预后差等特点,手术切除是目前唯一可能治愈的方式。但是胰腺癌手术切除率极低,仅有10-20%左右的患者可能手术切除。即便如此,可切除患者5年生存率也仅20%左右。化疗是胰腺癌治疗的重要辅助手段之一,术前新辅助化疗可能提高局部进展期胰腺癌的切除率,术后辅助化疗可能改善预后,不可切除胰腺癌化疗可以改善生存期,提高生活质量。但是胰腺癌对化疗高度不敏感。因此,寻找一种科学可行的方法来增强其化疗敏感性成为胰腺癌治疗领域研究的热点和难点。XIAP是IAP家族中凋亡抑制作用最强的因子之一,与胰腺癌的异常增殖及凋亡抵抗等有关,并与其化疗抵抗密切相关。Survivin是IAP家族的另一独特的凋亡抑制因子,与XIAP存在相互作用且有功能不同的剪切变构体。Bcl-2家族是研究较为透彻的凋亡调节蛋白。Akt是细胞生存信号通路PI3K/Akt的重要蛋白,与XIAP关系密切。本研究的主要内容包括：①探讨胰腺癌细胞系中XIAP的表达与化疗抵抗之间的关系,②探讨运用慢病毒载体介导RNAi稳定抑制胰腺癌细胞系中XIAP表达对胰腺癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响,③初步探讨XIAP稳定抑制后对胰腺癌增殖、凋亡及化疗敏感性影响的可能机制。方法①体外培养人胰腺癌细胞株Panc-1、SW1990、Bxpc-3和Mia-paca2,实时定量real-time RT-PCR和Western-blot检测不同细胞株XIAP的表达情况,MTT检测不同细胞株的化疗敏感性。Pearson线性相关分析XIAP表达和IC50之间的关系。②构建针对XIAP的shRNA慢病毒载体,包装获得高滴度病毒后感染胰腺癌细胞株SW1990, real-time RT-PCR和Western-blot检测对XIAP表达的抑制效率。筛选稳定克隆并扩大培养,检测稳定抑制XIAP表达后对细胞体内外增殖能力（MTT、克隆形成实验及裸鼠成瘤等方法）、凋亡（caspase-3/7活性检测、DAPI核染及流式细胞术等方法）及化疗敏感性（MTT法）的影响。③XIAP稳定抑制后,Western-blot分析Survivin及p-Akt表达的改变,real-time RT-PCR分析Bcl-2家族及Survivin剪切变构体的表达改变,探索相关机制。结果①胰腺癌细胞株中均有XIAP表达,且表达水平高低与化疗敏感性相关,表达最高的Panc-1化疗抵抗性最强,表达居中的SW1990、Mia-paca2化疗中度抵抗,而表达最低的Bxpc-3对化疗最敏感。②针对XIAP成功构建3条shRNA慢病毒载体：Lv-shRNA-XIAP-1 （Lv-X1）、Lv-shRNA-XIAP-2（Lv-X2）及Lv-shRNA-XIAP-3（Lv-X3）并包装出较高滴度的慢病毒颗粒。感染结果显示慢病毒载体能高效、稳定且长期的抑制XIAP表达。结果表明Lv-X1对SW1990细胞的XIAP mRNA和蛋白抑制最为显著,rnRNA （?）（?）制率达（91.24±2.78）%,蛋白抑制率达（94.02±0.70）%（p＜0.05）体内试验MTT绘制生长曲线及克隆形成实验结果显示Lv-X1、Lv-X2及Lv-X3细胞增殖显著受到抑制,尤其以Lv-X1最为明显；体外裸鼠成瘤实验检测同样显示Lv-X1细胞成瘤能力显著受到抑制。caspase-3/7活性、DAPI核染及流式细胞技术检测凋亡均提示XIAP稳定抑制后caspase-3/7活性及凋亡率轻度增加但没有显著差异（p＞0.05）。但是化疗药物（5-FU或者吉西他滨）干预后能显著逆转其化疗抵抗,增强化疗药物的敏感性及显著增加caspase-3/7活性及细胞凋亡率（p＜0.05）,且呈时间及浓度相关性。③XIAP表达稳定抑制后对Survivin蛋白表达无显著影响（p＞0.05）,但是p-Akt蛋白水平显著下降（p＜0.05）。XIAP稳定抑制后对Bcl-2家族Bcl-2 mRNA无显著影响（p＞0.05）,而Bax、Bcl-xL及Bcl-xS mRNA显著增加（p＜0.05）；对Survivin剪切变构体Survivinα、Survivin-2B及Survivin△-Ex3 mRNA无显著影响（p＞0.05）结论①XIAP在胰腺癌细胞株Panc-1、SW1990、Bxpc-3及Mia-paca2中均有表达,且表达高低与化疗敏感性相关,是胰腺癌细胞株重要的耐药因子,②稳定抑制XIAP表达,能显著抑制胰腺癌细胞的体内外增殖能力,增加化疗药物诱导的凋亡并逆转化疗抵抗,提高化疗敏感性,③稳定抑制XIAP表达对Survivin表达无显著影响,但是能显著减少p-Akt蛋白的表达,后者可能是导致稳定抑制XIAP导致细胞体内外增殖能力显著下降的原因。
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