靶向抑制DNA修复基因Artemis增强肿瘤细胞放射敏感性的研究

论文摘要

研究背景放射治疗是现代肿瘤治疗的主要手段之一,但大多数恶性肿瘤存在不同程度的放射抗拒性,严重影响了放射治疗的疗效。克服这种放射抵抗性对改善肿瘤放射治疗效果具有重要临床意义。肿瘤细胞对放射线的敏感性主要取决于修复DNA损伤的能力。肿瘤细胞和正常细胞之间存在DNA修复机制的差异也提示DNA损伤修复蛋白是肿瘤放射增敏治疗的优秀靶点。从分子机制上来说,电离辐射（IR）对细胞的主要致死性损伤为DNA双链断裂（DSBs）。DSBs不能修复或错误修复会导致染色体缺失、变异最终发生细胞死亡。在哺乳动物细胞,DSBs主要通过非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复,并且伴随着由ATM启动的多种信号通路反应,调节细胞周期阻滞等,以便协助修复。NHEJ途径至少涉及7个主要成员的协同作用DNA-PKcs, KU70/KU80, Artemis, XRCC4, DNA连接酶IV, XLF。NHEJ蛋白的任一成员的缺陷或失活均表现为DSBs修复缺陷而引起的对IR敏感性的增加。抑制NHEJ修复途径和ATM依赖的修复反应来增加肿瘤细胞的放射敏感性已有研究但仍很滞后,需做不断的研究和革新Artemis是目前研究最热门的NHEJ修复分子。它的突变或缺陷会导致人类放射敏感性严重联合免疫缺陷（RS-SCID）综合症,表现为V（D）J重组障碍而致免疫功能缺陷,以及对离子射线严重的敏感性。研究表明,IR诱导的DSBs损伤修复中Artemis受DNA-PKcs的调节参与复杂染色体断端的处理,受ATM的调节参与染色质重构和端粒维持,细胞周期检查点调控等方面的细胞修复反应。因此,Artemis在IR诱导的DSBs的修复反应中,不仅是效应器也是信号传递分子,其在整合DNA损伤信号通路,细胞反应和DNA修复方面具有独特的关键性作用Artemis在DSBs修复中的重要作用解释了Artemis缺陷细胞对IR的高敏感性,同时也提示Artemis可以作为放射增敏的新靶点。然而,目前对于抑制Artemis在增加肿瘤细胞放射敏感性方面所起的作用及相关机制尚无开展,在本研究中,我们对此进行了探索,并且提出了Artemis作为肿瘤放射增敏治疗靶点的潜在价值和临床意义实验方法及结果1 Artemis在人类结直肠癌中的表达及与其放射敏感性的相关性研究研究Artemis在肿瘤内的表达情况及与放射敏感性之间的相关性对于建立以Artemis为靶点的放射增敏的策略是非常必要的。我们以50例临床获取的人类结直肠癌组织及癌旁正常组织样本为研究对象,通过定量PCR的方法,评估了Artemis在癌及癌旁组织中的表达情况,发现了28%的结肠癌组织中Artemis是高表达的,然后又在多个肠癌细胞系,使用定量PCR及克隆生存实验等评估了Artemis表达水平及其对放射线的敏感性,发现了二者之间存在的相关性,建立了Artemis作为放射增敏靶点的必要性及潜在价值。2慢病毒介导的RNAi技术靶向抑制Artemis表达增强肠癌细胞的放射敏感性及相关机制研究Artemis亚等位基因造成的Artemis的显著低水平表达的细胞表现出类似于Artemis缺陷细胞的高放射敏感性,这也提示靶向沉默Artemis可能可以增加对放射线的敏感性。因此,我们筛选了可以有效沉默Artemis的siRNA靶点,并构建入慢病毒载体,借此沉默了人结直肠癌细胞系RKO细胞的Artemis蛋白,然后通过克隆生存实验及MTT实验并结合裸鼠体内实验证实了沉默Artemis的RKO细胞对IR以及其他DNA损伤剂的敏感性明显的增加。使用γH2AX焦点分析法检测了Artemis沉默RKO细胞的DSBs修复动力学的改变,证明了其DNA损伤修复的损害发生在8小时之后的慢修复通路,表现了与Artemis缺陷细胞相似的表型。最后通过各种凋亡检测方法及免疫印迹的方法证明沉默Artemis对RKO细胞在DNA损伤剂诱导下发生了更多的凋亡事件,其中涉及了p53/p21通路相关的凋亡信号通路。3 Artemis显性失活突变体对肿瘤细胞的放射增敏作用及相关机制的研究失活基因的方法除了siRNA干扰以外,还有一种引入显性失活突变体的方法。显性失活突变的方法比siRNA更加特异,适用范围更广泛。Artemis的一些突变体形式具有显性失活作用已有报道。基于对Artemis蛋白结构和功能调节的深刻理解的基础之上,在本研究中,我们通过基因克隆的方法构建了C末端缺失且无核酶活性的Artemis突变体并将其过表达在放射抗拒肿瘤细胞系HeLa中,使用克隆生存分析法及MTT法,证明了Artemis突变体可以增加肿瘤细胞对DNA损伤剂的敏感性,并使用γH2AX焦点分析证明其对DNA修复的影响是类似于Artemis缺陷细胞的,最后通过免疫共沉淀及磷酸化分析证明了Artemis突变体具有竞争结合Artemis上游蛋白DNA-PKcs和ATM的能力而损害了内源性Artemis的磷酸化过程,因而可能损害了Artemis相关的细胞DNA损伤修复反应。结论1、首次研究了Artemis在肿瘤组织内的表达情况,证明了Artemis表达在不同的组织间存在明显的异质性,部分结直肠癌肿瘤组织内Artemis的表达高于癌旁正常组织,而且肿瘤细胞内高水平的Artemis表达与其放射抗拒存在一定的相关性,我们提出在Artemis高表达且放射线抗拒的结直肠癌,靶向抑制Artemis增强肿瘤对放射线的敏感性且利于降低周围组织损伤的治疗策略有重要临床意义。2、构建了具有高干扰效率Artemis慢病毒RNAi载体,在目的细胞沉默了Artemis蛋白,然后在体内体外实验均证明了靶向沉默Artemis蛋白可以增加肿瘤细胞对IR及DNA损伤剂CPT等的敏感性,其中涉及p53/p21相关凋亡通路的参与。这是国际上首次通过靶向抑制Artemis表达而调节了肿瘤放射敏感性的研究,它为临床上治疗放疗抵抗或化疗抵抗的结直肠癌提供改善治疗效果的新策略。3、构建了人Artemis蛋白的突变体质粒载体,证明了过表达突变体Artemis可以增加肿瘤细胞对IR及DNA损伤剂Etoposide的敏感性,用显性失活的方法证明了Artemis作为放射增敏治疗的靶点的可行性,并为此提供了更多的靶向手段,而且更进一步表明了靶向Artemis在肿瘤放射增敏方面的潜在价值：

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 缩写及符号清单
• 插图及附表清单
• 目次
• 1 引言
• 参考文献
• 2 Artemis在人类结直肠癌中的表达及与其放射敏感性的相关性研究
• 2.1 材料和仪器
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论与小结
• 本部分结论
• 参考文献
• 3 RNAi靶向沉默Artemis表达增强肠癌细胞的放射敏感性的研究
• 引言
• 3.1 材料和仪器
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论和小结
• 本部分结论
• 参考文献
• 4 Artemis显性失活突变体对肿瘤细胞的放射增敏作用的研究
• 引言
• 4.1 材料和仪器
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论和小结
• 本部分结论
• 参考文献
• 5 结论
• 6 创新点
• 综述
• 参考文献
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果