论文摘要
背景与目的糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见微血管并发症之一，也是导致终末期肾脏疾病（end stage renal disease，ESRD）的主要原因。微量白蛋白尿是DN早期临床诊断指标，而大量蛋白尿的出现则预示着肾小球病变不可逆转，DN患者在短期内将进入ESRD。因此，深入研究蛋白尿发生机制为临床防治DN提供新的线索有着重要的意义。肾小球滤过屏障的完整性决定着其对蛋白质的选择通透性，肾小球基底膜中的硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）对滤过膜维持电荷屏障起关键作用。乙酰肝素酶（heparanase，HPA）为β-D-内切糖苷酶，可以选择性降解肾小球基底膜HS侧链，在蛋白尿发生机制中发挥着重要作用。同样，podocin作为足细胞裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）的重要组分参与构成滤过膜机械屏障，近期研究表明其与肾病综合征等多种肾脏疾病蛋白尿的发生密切相关。而二者在DN蛋白尿发生中的作用国内、外报道甚少。因此，本研究旨在检测糖尿病肾病大鼠肾组织HPA和podocin的表达情况并分析其与蛋白尿发生发展的相关性，以探讨糖尿病肾病蛋白尿发生的分子机制。方法1、建立糖尿病肾病大鼠动物模型。体重180-200g健康SD雄性大鼠26只，随机分为正常对照组（NC组n=6）和糖尿病肾病组（DN组n=20）。DN组给予一次性腹腔注射0.1mmol/L链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）60mg/kg，72小时后检测血糖，随机血糖≥16.65mmol/L、尿糖3+～4+为造模成功。DN组再随机分为DN6W组和DN12W组，每组各10只。NC组腹腔注射等量的枸橼酸缓冲液作为对照。2、标本的收集。分别于造模后6W和12W用金属代谢笼收集大鼠24小时尿量；留取血样，送检24h尿蛋白定量和生化指标。处死，迅速取出双肾，左肾称重后液氮冻存备用；取右肾用10％甲醛固定留做光镜及免疫组化。3、采用免疫组织化学和逆转录聚合酶联反应（reverse transcription PCR）技术分别从蛋白和基因水平检测各组大鼠肾组织HPA和podocin的表达变化。结果1、DN两组的相对。肾重、24h尿量及24h尿蛋白定量与正常对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。2、DN组HPA蛋白和基因表达与正常对照组相比均显著增高（P＜0.001）。HPA蛋白阳性区平均积分光密度值：正常组24.57±1.99、DN6W组78.77±2.73、DN12W组87.59±10.22，三组之间具有统计学差异（F=11.171 P＜0.001）。HPA mRNA表达半定量分析：正常组0.24±0.03、DN6W组0.89±0.14、DN12W组1.09±0.13，三组间差异具有统计学意义（F=11.196 P＜0.001）。HPA蛋白和基因表达与大鼠尿蛋白定量之间均存在正相关趋势（r=0.783 P＜0.001；r=0.793 P＜0.001）。3、DN组podocin蛋白表达与正常组相比显著性降低（P＜0.001）。podocin蛋白阳性区平均积分光密度值：正常组78.69±4.33、DN6W组68.57±5.75、DN12W组55.27±7.46，三组之间有统计学差异（F=11.654 P＜0.001）。podocin基因表达半定量分析显示DN6W组表达增高，DN12W组表达又回落，三组间差异无统计学意义（F=0.98 P＞0.05），与正常组相比也没有统计学差异（P＞0.05）。podocin蛋白表达与大鼠尿蛋白定量之间存在负相关趋势（r=-0.833 P＜0.001），而podocin基因表达与尿蛋白之间无相关性（r=0.320 P＞0.05）。4、HPA蛋白和podocin蛋白表达之间存在负相关趋势（r=-0.653 P＜0.05），而二者基因表达之间无相关性（r=0.265 P＞0.05）。小结1、HPA表达增高与DN大鼠蛋白尿的发生有关。2、podocin蛋白表达减少促使DN大鼠蛋白尿的发生。podocin mRNA水平升高，与其蛋白表达不相一致，推测此现象是DN早期足细胞对podocin蛋白表达下调在mRNA水平的代偿性反应。3、HPA和podocin在DN蛋白尿的发生机制中可能存在共同的通路。