迟缓爱德华氏菌鞭毛蛋白的研究

论文摘要

从罹患“腹水病”日本鳗鲡体内分离到1株细菌,经生化鉴定结果表明分离菌是迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda,ET）,将其命名为ETY。以腹腔注射感染日本鳗鲡,通过柯赫法则验证了ETY是日本鳗鲡的致病菌。建立了巢氏PCR检测方法并用于检测拟似爱德华氏菌分离株,经生化鉴定平行验证,结果表明巢氏PCR法检测结果与生化鉴定结果高度吻合,证明巢氏PCR技术可以用于迟缓爱德华氏菌快速鉴定和初筛。制备了ETY和ETV二种迟缓爱德华氏菌抗血清并用于爱德华氏菌分离株的血清分型,试验结果显示ETY,ETLi和ET030906属同一血清型,ETV属另一种血清型。采用不同的方法提取、纯化迟缓爱德华氏菌鞭毛蛋白（Edwardsiella tardaflagellin,ETFP）,比较了各种方法的纯化结果,筛选出最佳的ETFP提取、纯化方法。制备了鼠抗ETFP血清和鼠抗ETY全菌血清,应用ELISA和Western-blotting分析了ETFP的抗原性和免疫原性。试验结果表明:酸化高速离心法可获得高纯度的ETFP,其分子量约为44kDa;纯化的ETFP能被鼠抗ETY全菌血清识别,鼠抗ETFP血清能特异性地识别纯化的ETFP和爱德华菌菌体裂解产物中44kDa的蛋白条带,证实了纯化的ETFP具有抗原性和免疫原性,可作为亚单位疫苗的候选抗原。借助巢式PCR技术从ETY的基因组克隆到其鞭毛蛋白基因（ETF）。该基因开放阅读框为1257bp,编码418个氨基酸,推导的蛋白分子量为43.951kDa。将ETF基因定向连接到pET32b（+）表达载体并转化至E.coli BL21（DE3）,获得可溶性表达,ETFP-TrxA融合蛋白的表达量达到菌体蛋白总量的50.1%。ELISA和Western-blotting分析结果表明:ETFP-TrxA融合蛋白与ETY的鞭毛蛋白具有相似的抗原性和免疫原性。免疫试验结果表明:ETFP-TrxA融合蛋白与ISA763A佐剂乳化后接种日本鳗鲡,于免疫后第21天攻毒,免疫保护率可达100%。本研究建立了迟缓爱德华氏菌的巢氏PCR检测法;应用酸化高速离心法提取了高纯度的迟缓爱德华氏菌鞭毛蛋白;成功地克隆了鳗源迟缓爱德华氏菌的ETF基因,并获得了ETF基因的高效表达;证实了ETFP-TrxA融合蛋白与ETFP具有相似的抗原性和免疫原性,并能诱导免疫鱼产生良好的免疫力;上述研究结果为迟缓爱德华氏菌病临床快速检测和鞭毛蛋白亚单位疫苗研发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.1.1 爱德华氏菌的分类地位和生物学特性
• 1.1.1.1 爱德华氏菌的分类地位
• 1.1.1.2 爱德华氏菌的生物学特性
• 1.1.2 爱德华氏菌病的危害
• 1.1.2.1 人类爱德华氏菌病
• 1.1.2.2 鱼类爱德华氏菌病
• 1.1.3 迟缓爱德华氏菌血清分型
• 1.1.4 致病型爱德华氏菌微生物学检验
• 1.1.4.1 细菌学检验方法
• 1.1.4.2 免疫学检查方法
• 1.1.4.3 迟缓爱德华氏菌的综合检验法
• 1.1.5 爱德华氏菌的防治
• 1.1.6 迟缓爱德华氏菌的毒力因子
• 1.1.7 迟缓爱德华氏菌的鞭毛蛋白功能和研究现状
• 1.2 本研究的目的及意义
• 第2章 菌株鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 实验动物
• 2.2.3 试剂
• 2.3 方法
• 2.3.1 菌株培养
• 2.3.2 回归实验
• 2.3.2.1 攻毒鱼
• 2.3.2.2 症状观察
• 2.3.2.3 细菌分离
• 2.3.2.4 生化鉴定
• 2.3.3 巢氏PCR鉴定法的建立
• 2.3.3.1 引物设计
• 2.3.3.2 PCR反应体系及反应条件
• 2.3.4 血清型分析
• 2.3.4.1 抗原的制备
• 2.3.4.2 兔抗血清的制备
• 2.3.4.3 兔抗血清效价的测定
• 2.4 结果及分析
• 2.4.1 回归实验
• 2.4.1.1 攻击鱼症状
• 2.4.1.2 分离细菌培养结果
• 2.4.1.3 细菌鉴定结果
• 2.4.2 巢氏PCR鉴定
• 2.4.3 血清型分析
• 2.4.3.1 兔抗血清制备
• 2.5 讨论
• 第3章 迟缓爱德华氏菌鞭毛蛋白的提取和分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 试验动物
• 3.3 方法
• 3.3.1 迟缓爱德华氏菌鞭毛蛋白的提取
• 3.3.1.1 酸化超速离心法
• 3.3.1.2 酸化高速离心法
• 3.3.1.3 热激法
• 3.3.2 抗血清的制备
• 3.3.2.1 抗原的制备
• 3.3.2.2 抗血清的制备
• 3.3.3 免疫原性和抗原性的测定
• 3.4 结果和分析
• 3.4.1 不同方法比较的结果
• 3.4.2 抗原ETF的制备
• 3.4.3 ELISA结果
• 3.4.4 Western-blotting结果分析
• 3.5 讨论
• 第4章 迟缓爱德华氏菌的鞭毛基因的克隆和原核表达
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 质粒和菌株
• 4.2.1.1 质粒
• 4.2.1.2 菌株
• 4.2.2 实验动物
• 4.3 试剂
• 4.4 主要仪器
• 4.5 方法
• 4.5.1 引物设计
• 4.5.2 迟缓爱德华氏菌ET.Y.基因组的提取
• 4.5.3 PCR扩增迟缓爱德华氏菌ET.Y.鞭毛基因
• 4.5.4 PCR产物纯化
• 4.5.5 大肠杆菌E.coli DH5a、E.coliDE3 （BL21）感受态细胞制备
• 4.5.6 ETF基因的克隆
• 4.5.7 PCR鉴定阳性克隆
• 4.5.8 酶切鉴定
• 4.5.9 ETF基因表达载体的构建
• 4.5.10 ETFP基因表达产物ETFP-TrxA融合蛋白的定位
• 4.5.11 ETFP基因表达条件优化
• 4.5.11.1 IPTG浓度对ETFP-TrxA融合蛋白表达量的影响
• 4.5.11.2 诱导时间对ETFP-TrxA融合蛋白表达量的影响
• 4.6 结果和分析
• 4.6.1 ETF基因的克隆、鉴定
• 4.6.2 重组表达质粒构建
• 4.6.3 ETF基因结构分析
• 4.6.4 ETF基因表达产物ETFP-TrxA融合蛋白的定位
• 4.6.5 ETFP基因表达条件优化
• 4.6.5.1 诱导时间对ETFP-TrxA融合蛋白表达量的影响
• 4.6.5.2 IPTG浓度对ETFP-TrxA融合蛋白表达量的影响
• 4.7 讨论
• 第5章 基因表达融合蛋白的特性分析
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 菌株
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 实验动物
• 5.3 方法
• 5.3.1 ETFP-TrxA融合蛋白的制备
• 5.3.2 鞭毛蛋白抗原性分析
• 5.3.3 ETFP-TrxA融合蛋白抗原性分析
• 5.3.4 免疫试验
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 融合蛋白抗原性分析
• 5.4.2 免疫印迹分析目的蛋白
• 5.4.3 攻毒保护实验
• 5.5 讨论
• 第6章 论文小结
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 攻读学位期间参与的科研项目和科研成果
• 致谢
• 个人简历