以银翘药对为对象探讨建立中药药效物质快速发现的方法

论文摘要

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花,连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspense（Thunb.）Vahl的干燥果实,二者均为常用清热解毒中药。金银花清热解毒,偏于上半身之热;而连翘清热解毒,散结消肿,便于透达全身之热。二药配伍,清热解毒力量倍增,流通气血以消肿散结止痛,且银翘药对是临床上公认的常用有效药对。所以本课题在总结前人研究工作的基础之上,以银翘药对为示范性研究对象,探讨建立适宜于复杂体系——中药或中药复方的药效物质基础快速发现的方法。该模式的核心思想是:建立在“入血成分才可能是药效成分”的基础之上,通过比较研究银翘药对在大鼠肠管外翻模型中的吸收成分和其在大鼠体内入血成分之间的相关关系,从而采用体外吸收模型来替代整体动物模型的可行性研究,达到初步建立快速、简便和低成本的药效物质基础快速发现的方法。围绕着本课题核心思想,对银翘药对的主要药效作用,银翘药对有效部位体内外过程,金银花、连翘以及银翘药对药材配伍后的化学成分变化和体内外过程,金银花、连翘、银翘药对药材煎煮过程的化学成分变化、银翘药对水溶性化学成分研究等进行了较系统的研究,以期探讨建立适宜于复杂体系——中药或中药复方的药效物质基础快速发现的方法,初步揭示银翘药对可能的药效物质基础,为对银翘药对进行有效和科学的质量控制提供部分依据。在药效学方面,采用巴豆油致小鼠耳廓肿胀模型和酵母致大鼠发热模型筛选金银花、连翘以及银翘药对药材不同配伍比例的抗炎解热作用,试验结果表明:银翘药对的抗炎解热作用均优于单味药金银花和连翘,在银翘药对药材不同的配伍比例中,银翘药对1:1的抗炎解热作用优于银翘药对药材的其它配伍比例。在得到银翘药对药材最佳配伍比例的基础上,采用巴豆油致小鼠耳廓肿胀模型和酵母致大鼠发热模型筛选银翘药对1:1,其大孔树脂水洗部位和乙醇洗部位的抗炎解热作用,试验结果表明:银翘药对1:1的大孔树脂乙醇洗脱部位的抗炎解热作用优于其水洗部位,且优于原药（银翘药对药材1:1）。在得到银翘药对有效部位之后,本论文以银翘药对有效部位为研究对象,初步探讨建立了适宜于复杂体系——中药或中药复方的药效物质基础快速发现的方法。主要包括了以下内容:银翘药对有效部位在Caco-2细胞模型中的吸收,结果发现:Caco-2细胞吸收模型所提供的信息量相对较少。为了得到更多的信息,采用大鼠肠管外翻模型来研究银翘药对有效部位的吸收,结果发现:大鼠肠管外翻模型能吸收银翘药对有效部位中的主要色谱峰。为了说明直接采用大鼠肠管外翻模型来研究银翘药对的合理性,将银翘药对直接灌胃后,不同时间点取在体大鼠胃液和肠液样品进行HPLC-DAD分析,结果发现:银翘药对在大鼠灌胃后,在胃肠液中没有新的主要色谱峰产生或消失,说明直接采用大鼠肠管外翻模型来研究银翘药对有效部位的吸收是可行的。为了探讨银翘药对的药效物质基础,研究了银翘药对有效部位的入血成分,试验结果发现:银翘药对有效部位的主要入血成分与大鼠肠管外翻模型中的主要吸收成分一致。为了进一步验证银翘药对的药效物质基础,研究了银翘药对有效部位在大鼠组织脏器中的分布,结果发现银翘药对主要在心和肺中有分布,且心肺中分布的主要色谱峰与大鼠肠外翻吸收模型中的主要吸收成分一致。综合上面的试验结果可知:银翘药对的药效物质基础可能是入血成分中的主要色谱峰,银翘药对有效部位的主要入血成分与肠外翻模型中的主要吸收成分一致,说明以银翘药对为研究对象,初步建立了采用体外吸收模型来替代整体动物模型的可行性研究,达到了初步建立快速、简便和低成本的药效物质基础快速发现的方法,给中药或中药复方质量控制提供了一定的依据。在建立该药效物质基础快速发现的方法之后,研究了金银花、连翘以及银翘药对药材不同配伍比例的样品在大鼠肠管外翻模型中的吸收,试验结果发现:在大鼠肠管外翻模型中,金银花、连翘以及银翘药对药材不同配伍比例样品的主要色谱峰都能吸收进入小肠段,在吸收过程中并没有主要成分的产生或消失,证明了上述所建立的药效物质基础快速发现方法的技术适应性,同时也说明了主要色谱峰之间的比例关系影响银翘药对的药效物质基础。因此接下来对金银花、连翘以及银翘药对药材不同配伍比例样品在人工胃肠液中进行了孵育,结果发现:经人工胃液和人工肠液孵育后的金银花、连翘及银翘药对药材不同配伍比例样品的主要色谱峰都能在相应的药材样品中找到归属,在孵育过程中并没有量大成分的产生或消失,但经人工肠液孵育后样品的主要色谱峰面积均高于经人工胃液孵育后相应样品的相应色谱峰面积,说明人工胃肠液能够影响样品中主要色谱峰的比例。为了深入探讨银翘药对的药效物质基础,富集主要药效成分的量,接下来研究了银翘药对水溶性化学成分。首先采用HPLC-DAD研究金银花、连翘和银翘药对1:1之间的化学成分差异,试验结果表明:银翘药对1:1中的主要色谱峰都能归属到单味金银花和连翘中,并没有明显的新色谱峰产生和消失,提示可以通过研究单味药金银花和连翘的水溶性化学成分来实现银翘药对的水溶性化学成分研究。因此,接下来对单味药金银花和连翘的水溶性成分进行了研究。采用溶剂法和各种色谱分离技术,对金银花、连翘的水溶性成分进行了较为系统的研究。从金银花中分离得到16个化合物,鉴定了16个化合物,包括6个环烯醚萜苷,5个三萜皂苷,2个黄酮、3个其它类。其中3-O-β-D-glucopyranosyl hederagenin28-O-β-D-glucopyranosyl-（1→2）-[β-D-xylopy-ranosyl-（1→6）]-β-D-glucopyranosylester和3-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-[α-L-rham-nopyranosyl-（1→2）-[β-D-xylo-pyranosyl-（1→6）]-β-D-glucopyranosyl]oleanolic acid为新化合物;2,6-dimethyl-6-hydroxyl-2,7-diene-1-octyl alcohol glucopyranoside为首次从该属植物中分离得到;獐芽菜苷,loganin和centauroside为首次从该种中分离得到。从连翘水煎剂中分离得到了18个化合物,鉴定了15个,包括4个木脂素类、3个有机酸类、2个黄酮、其它类6个其中吴茱萸次碱为首次从该属植物中分离得到。本研究是在中医药学理论和实践的指导下,将天然药物化学、分析化学、药理学、药代动力学等手段相结合,研究了银翘药对的主要药效、配伍变化、化学成分以及体内外过程,初步阐明银翘药对的可能药效物质基础,为中药或中药复方的药效物质基础研究模式提供了很好的参照方法和思路,为中药现代化做了有意义的探索性和创新性工作。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第一节 适宜于中医药特点的复方药效物质基础研究模式的探讨
• 1 中药复方药效物质基础研究模式
• 2 中药复方药效物质基础研究的发展趋势
• 3 结语
• 参考文献
• 第二节 忍冬属植物国内外研究现状
• 1、本草考证
• 2、资源调查
• 3、化学成分研究
• 4、质量控制研究
• 5、药理研究
• 6、实践应用
• 7、展望
• 参考文献
• 第三节 连翘属研究概况
• 1 本草考证
• 2.资源调查
• 3.化学成分
• 4 质量控制研究
• 5 药理作用
• 6 小结
• 参考文献
• 第四节 含银翘药对制剂的主要研究进展
• 1 本草考证
• 2 资源及分布
• 3 常见含银翘药对的制剂
• 4 含银翘药对制剂制备工艺
• 5 银翘药对质量控制
• 6 药理研究
• 7 毒理研究
• 8 临床应用
• 9 不良反应
• 10 小结
• 参考文献
• 第五节 中药药代动力学研究概况简介
• 1、中药药代动力学概念
• 2、中药药代动力学的研究发展概况
• 3、中药药代动力学研究的主要方法
• 4、中药药代动力学新的研究理论和方法
• 5、中药药代动力学研究展望
• 6 小结
• 参考文献
• 第二章 银翘药对的药效学研究
• 第一节 金银花、连翘以及银翘药对不同配伍比例的药效学研究
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.结果
• 4 抗炎验证试验
• 5 小结
• 参考文献
• 第二节 银翘药对有效部位的药效学筛选研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 小结
• 第三章 探讨建立中药药效物质基础快速发现的方法
• 第一节 银翘药对有效部位在Caco-2细胞模型中吸收的研究
• 1 仪器、材料与试剂
• 2 方法与结果
• 3 小结与讨论
• 参考文献
• 第二节 银翘药对有效部位在大鼠肠外翻模型中吸收的研究
• 1 仪器、材料与试剂
• 2 方法与结果:
• 3 小结与讨论
• 第三节 银翘药对有效部位在大鼠胃液和肠液中的研究
• 1 仪器、材料与试剂
• 2 方法与结果
• 3 小结与讨论
• 第四节 银翘药对有效部位在大鼠体内入血成分分析
• 2 方法与结果
• 3 小结与讨论
• 第五节 银翘药对有效部位在大鼠组织脏器中的分布研究
• 1 仪器、材料与试剂
• 2 方法与结果
• 3 小结与讨论
• 第四章 金银花、连翘和银翘药对在肠外翻、人工胃液和人工肠液中的研究
• 第一节 金银花、连翘和银翘药对在大鼠肠外翻模型中吸收的研究
• 1 仪器、材料与试剂
• 2 方法与结果
• 3 小结
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二节 金银花、连翘和银翘药对不同配伍比例在人工胃液、人工肠液中的转化研究
• 2 方法与结果
• 3 小结
• 4 讨论
• 参考文献
• 第五章 银翘药对化学成分研究
• 第一节 RP-HPLC对金银花和连翘单煎、单煎后合并及混煎的分析
• 1 实验材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二节 金银花化学成分研究
• 1.概述
• 2.化合物的结构解析
• 3、实验部分
• 4 小结
• 参考文献
• 第三节 连翘化学成分研究
• 1.概述
• 2 实验部分
• 3 小结
• 参考文献
• 第六章 结果与讨论
• 致谢
• 个人简历
• 博士期间发表论文:
• 附图