罗格列酮防止β淀粉样蛋白寡聚体引起的突触发育损伤的作用及机制研究

论文摘要

目的1.研究可溶性β淀粉样蛋白寡聚体42（soluble amyloid-β protein42oligomers, SO Aβ42）处理对体外培养大鼠海马神经元树突丝的密度、运动速度和长度以及树突棘密度的潜在损伤效应，以了解SO Aβ42对海马神经元突触发育的影响。2.研究过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma, PPAR）激动剂罗格列酮预处理对SO Aβ介导的海马神经元突触发育损伤的影响及其量效关系，并探讨PPARγ在罗格列酮发挥功能中的作用。3.探寻罗格列酮在以上研究中发挥潜在作用的可能性机制。最终为进一步了解阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease, AD）的发病机制以及探寻AD的治疗靶点和治疗药物提供实验依据。方法取新生第1天Wistar大鼠的海马回做原代神经元培养。在体外培养第5天（day5in vitro, DIV5），用定位在膜上的绿色荧光蛋白（F-GFP）和GFP标记的肌动蛋白（GFP-actin）对神经元进行共转染，以显示神经元树突及其突起的详细形态学细节；在DIV7和DIV15，实验组给予神经元500nM SO Aβ42孵育3h，干预组在给予SO Aβ42孵育前对神经元分别给予0.1μM、0.5μM，5μM罗格列酮或5μM罗格列酮+5μM GW9662预孵育24h。通过活细胞成像方法观察各试验组DIV7神经元树突丝的密度、运动速度和长度以及DIV15神经元树突棘密度的情况。其次，在DIV5，用F-GFP、GFP-actin和靶向线粒体表达的红色荧光蛋白（Mitochondrially targeted red fluorescent protein, MitoRed）对神经元进行共转染，以显示神经元树突和其突起以及神经元线粒体的形态学细节；在DIV15，实验组给予神经元500nM SO Aβ42孵育3h，干预组在给予SO Aβ42孵育前对神经元给予5μM罗格列酮预孵育24h，通过活细胞成像方法观察相应试验组DIV15神经元树突中线粒体分布的情况。结果1.单独500nM SO Aβ42处理3h导致DIV7大鼠海马神经元树突丝的密度明显下降；罗格列酮预处理24h以剂量依赖的方式逆转SO Aβ42介导的树突丝密度减小。SO Aβ42和罗格列酮处理均不引起树突丝的运动速度和长度发生改变。2.单独500nM SO Aβ42处理3h引起DIV15大鼠海马神经元树突棘密度显著性减小；罗格列酮预处理24h以剂量依赖的方式逆转SO Aβ42介导的树突棘密度下降。3.5μM PPARγ特异性拮抗剂GW9662和5μM罗格列酮对神经元共同预处理有效阻断5μM罗格列酮逆转SO Aβ42介导的神经元树突丝或树突棘密度下降。4.单独500nM SO Aβ42处理3h降低了DIV15大鼠海马神经元树突中线粒体总长度与对应树突干总长度的比值、树突中离散线粒体的密度以及含线粒体的树突棘数目与总树突棘数目的比例，SO Aβ42处理引起的该现象在给予神经元5μM罗格列酮预处理24h后被有效逆转。SO Aβ42和罗格列酮处理均不改变树突中线粒体的长度。结论SO Aβ42处理对体外培养大鼠海马神经元的突触发育存在损伤作用，导致神经元的突触数目下降；罗格列酮预处理可以浓度依赖地逆转SO Aβ42介导的神经元突触发育损伤，该效应通过罗格列酮激活PPARγ受体起作用。罗格列酮的保护效应机制可能与其可以逆转SO Aβ42介导的神经元树突中线粒体分布异常，包括树突中线粒体数目减少以及含线粒体的树突棘比例下降有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 质粒
• 1.1.3 抗体
• 1.1.4 细菌培养用抗生素
• 1.1.5 使用试剂盒
• 1.1.6 细胞培养使用试剂
• 1.1.7 细胞转染使用试剂
• 1.1.8 细胞处理药物
• 1.1.9 常用溶液配方
• 1.1.10 主要实验仪器设备（表 1）
• 1.1.11 实验动物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 质粒 DNA 的转化、提取
• 1.2.2 SO Aβ42 的制备和检测
• 1.2.3 大鼠海马神经元原代培养
• 1.2.4 大鼠海马神经元转染
• 1.2.5 SO Aβ42 和罗格列酮处理
• 1.2.6 图像获取和分析
• 1.2.7 数据统计
• 2 结果
• 2.1 SO Aβ42、罗格列酮处理对海马神经元树突丝密度的影响
• 2.1.1 SO Aβ42 的鉴定
• 2.1.2 SO Aβ42 处理引起大鼠海马神经元树突丝密度减小
• 2.1.3 罗格列酮处理以浓度依赖的方式逆转 SO Aβ42 引起的大鼠海马神经元树突丝密度减小
• 2.2 SO Aβ42、罗格列酮处理对海马神经元树突丝的运动和长度的影响
• 2.3 SO Aβ42、罗格列酮处理对海马神经元树突棘密度的影响
• 2.3.1 SO Aβ42 处理引起大鼠海马神经元树突棘密度减少
• 2.3.2 罗格列酮处理以浓度依赖的方式逆转 SO Aβ42 诱导的大鼠海马神经元树突棘密度减小
• 2.4 GW9662 对罗格列酮逆转 SO Aβ42 诱导的树突丝和树突棘数目减少的作用的影响
• 2.5 SO Aβ42、罗格列酮处理对海马神经元树突中线粒体分布的影响
• 2.5.1 SO Aβ42 处理引起大鼠海马神经元树突中线粒体分布异常
• 2.5.2 罗格列酮逆转 SO Aβ42 引起的大鼠海马神经元树突中线粒分布异常
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 附录A 文献综述
• 参考文献
• 在学研究成果
• 致谢