辣椒胞质雄性不育的分子生理机制及亲缘关系研究

论文摘要

利用胞质雄性不育系（CMS）做母本是辣椒杂种优势利用的重要途径。但辣椒CMS的基础理论研究十分薄弱。本研究以湖南省蔬菜研究所选育的辣椒CMS-9704A、保持系（M-9704B）、恢复系（R-9701）和Fl为试材,研究了辣椒CMS的分子生理机制。辣椒属包含有5个栽培种和20-30个野生种,对于该属种间的亲缘关系,系统学家的观点不一。本研究采用辣椒11个植物种为试材,探讨了辣椒属内种间的亲缘关系。结果如下：1.在花粉败育阶段,CMS-9704A花蕾的超氧阴离子（O2-）,过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）的含量高于M-9704B。CMS-9704A花蕾的活性氧清除酶过氧化物酶（POD）,超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性也高于M-9704B。Pod,Mn-Sod,Cat1,Cat2和Cat3基因的表达量与酶活性在两系之间的变化一致。因此,CMS-9704A的不育性可能与CMS的花蕾长期处于由活性氧异常积累引起的慢性过氧化有关。2.在花粉败育的高峰期（小孢子单核靠边期）,CMS-9704A花蕾的抗坏血酸（ASA）,谷胱甘肽（GSH）、总ASA含量低于M-9704B,ASA/ （ASA+DHA）的比值在两系之间差异不显著；CMS-9704AGSH,总GSH含量和GSH-（GSH+GSSG）比值低于M-9704B,氧化性谷胱甘肽（GSSH）含量高于M-9704B;CMS-9704A的抗坏血酸过氧化物酶（APX）,谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）,谷胱甘肽还原酶（GR）酶活性和表达水平低于M-9704B。因此,CMS-9704A花蕾活性氧的异常积累与不育系非酶促抗氧化系统的异常有关。3.在小孢子败育过程中,CMS-9704A的苹果酸脱氢酶（Mdh）,NAPD-苹果酸酶（NADP-Me）,NADP-以柠檬酸脱氢酶（NADP-Icdh）和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6pdh）的表达均出现下调,而Ndpk的变化不明显。因此,由于Mdh,NADP-Me,NADP-Icdh和G6pdh的表达受到抑制,使三酸循环和磷酸戊糖途径受阻,导致能量供应不足,与CMS-9704A雄性不育有一定关系。4.对CMS-9704A,M-9704B及R-9701线粒体DNA进行了RAPD分析,共使用500条随机引物,其中有67引物在“三系”之间都得到了扩增产物,19条引物扩增结果在“三系”之间表现出了遗传多样性。在CMS-9704A与M-9704B的线粒体DNA之间也发现了明显的差异,在CMS-9704A中获得特异片段9条。5.从CMS-9704A中扩增到ATP合成酶亚基6（Atp6）和细胞色素C氧化酶亚基2（CoxⅡ）两个基因的部分序列Atp6-706和CoxⅡ-708,生物信息学分析发现分离的Atp6-706和CoxⅡ-708片段与GenBank中的茄科作物线粒体CoxⅡ和Atp6基因的相似性高达95%以上；在M-9704B和R-9701中均未能扩增到任何序列,说明辣椒CMS-9704A的CoxⅡ和Atp6基因与M-9704B和R-9701在线粒体DNA水平上存在差异,这种结构上的变化暗示可能与辣椒CMS相关。6.从CMS-9704A叶片DNA中扩增到一个与已经报道的与辣椒CMS基因ORF456同源的基因ORF168, ORF168的DNA序列与ORF456相比在第150个密码子处产生了一个碱基“C”的缺失,形成编码168个氨基酸的新序列。ORF168在CMS-9704A中稳定表达；核恢复基因对ORF168在F1的表达无影响,推测核恢复基因可能通过转录后剪接或翻译/翻译后修饰的途径对ORF168的转录产生影响。7.辣椒（Capsicum annuum L.） 6个变种的花粉呈矩圆形、椭圆形或圆形；极面观均为三裂片圆形；具三萌发沟,沟长达两极,沟的末端在极面上不连接形成合沟；花粉外壁纹饰在扫描电子显微镜下以刺-颗粒状复合纹饰为主。变种间在花粉形状和外壁纹饰方面有一定差异。根据其特征可以对辣椒进行分类。8.在辣椒5个栽培种之间,其亲缘关系的远近为C.annuum, C. frutescens, C. chinese, C. baccatum, C. pubesens。中国云南南部与美洲的C.frutescens辣椒资源具有较大的差异。对5份中国辣椒资源研究发现：C. frutescens种质辣椒素和二氢辣椒素含量要高于C. annuum种质。不同的辣椒种质之间辣椒素和二氢辣椒素含量及其比值的遗传多样性丰富。

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摘要

ABSTRACT

第一章:文献综述

1.1 辣椒雄性不育生理生化和分子生物学研究进展

1.1.1 辣椒雄性不育生理生化研究进展

1.1.2 辣椒雄性不育分子生物学研究进展

1.2 辣椒种质资源亲缘关系研究进展

1.2.1 辣椒的起源

1.2.2 辣椒的演化

1.2.3 辣椒的亲缘关系研究

1.2.4 孢粉学在植物分类、进化上的应用

1.2.5 DNA条形码技术在植物分类、进化上的应用

1.3 本研究的目的与意义

1.3.1 辣椒雄性不育的分子生理研究

1.3.2 辣椒属基于孢粉学和DNA条形码技术的亲缘关系研究

第二章辣椒胞质雄性不育性与活性氧代谢的关系

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.1.3 数据处理与分析

2.2 结果与分析

2^·-,H₂O₂和DNA含'>2.2.1 辣椒胞质雄性不育系9704A和保持系9704B的O₂^·-,H₂O₂和DNA含

2.2.2 辣椒胞质雄性不育系9704A和保持系9704B的POD、SOD和CAT酶活性的差异

2.2.3 辣椒胞质雄性不育系9704A和保持系9704B的活性氧保护酶Pod、Sod和Cat基因RT-PCR分析

2.3 讨论

第三章辣椒胞质雄性不育性与抗坏血酸代谢的关系

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.1.3 数据处理与分析

3.2 结果与分析

3.2.1 辣椒胞质雄性不育系9704A和保持系9704B的抗氧化物质ASA、DHA、GSH和GSSG含量的差异

3.2.2 辣椒胞质雄性不育系9704A和保持系9704B的抗氧化物质代谢酶APX、GPX、GR和y-GCS活性的差异

3.2.3 辣椒胞质雄性不育系9704A和保持系9704B的活性氧保护酶Apx、Gpx、Gr和γ-Gcs基因RT-PCR分析

3.3 讨论

3.3.1 辣椒胞质雄性不育系9704A和保持系9704B花蕾抗坏血酸、谷胱甘肽含量与ROS代谢的关系

3.3.2 辣椒胞质雄性不育系9704A和保持系9704B花蕾APX、GPX、GR和γ-GCS与ROS代谢的关系

第四章辣椒胞质雄性不育系能量代谢相关基因的表达研究

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.1.3 数据处理与分析

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第五章辣椒胞质雄性不育系9704A线粒体的RAPD分析

5.1 材料与方法

5.1.1 实验材料

5.1.2 实验方法

5.2 结果与分析

5.2.1 辣椒胞质雄性不育系9704A、保持系9704B、恢复系9701的RAPD分析

5.2.2 辣椒"三系"线粒体DNA的RAPD差异带分析

5.2.3 辣椒"三系"线粒体DNA的遗传差异

5.3 讨论

第六章辣椒胞质雄性不育相关基因CoxⅡ和Atp6片段的克隆与分析

6.1 材料与方法

6.1.1 实验材料

6.1.2 实验方法

6.2 结果与分析

6.2.1 CoxⅡ,Atp6基因片段的克隆结果

6.2.2 CoxⅡ,Atp6与其他茄科植物序列比较

6.3 讨论

第七章辣椒胞质雄性不育相关基因的基因克隆与表达分析

7.1 材料与方法

7.1.1 实验材料

7.1.2 实验方法

7.1.3 结果处理与分析

7.2 结果与分析

7.2.1 辣椒胞质雄性不育育性相关基因ORF456的DNA全序列PCR扩增

7.2.2 辣椒花蕾和叶片RNA的提取与cDNA的合成

7.2.3 辣椒胞质雄性不育系9704A雄性不育相关基因ORF168的全长cDNA序列的克隆与序列分析

7.2.4 ORF168基因在辣椒胞质雄性不育系9704A花蕾中的表达分析

7.2.5 ORF168基因在辣椒胞质雄性不育系9704A叶片中的表达分析

7.3 讨论

第八章辣椒（Capsicum annuum L.）花粉形态及其亲缘关系研究

8.1 材料与方法

8.1.1 材料

8.1.2 方法

8.2 结果与分析

8.2.1 花粉的大小、形状与萌发沟

8.2.2 花粉表面纹饰

8.2.3 亲缘关系研究

8.3 讨论

第九章辣椒属部分种质资源遗传多样性研究

9.1. 材料与方法

9.1.1 实验材料

9.1.2 实验方法

9.2 结果与分析

9.2.1 PCR扩增结果

9.2.2 序列分析

9.2.3 系统树的分析

9.2.4 辣椒素含量的测定

9.3 讨论

9.3.1 辣椒属部分种质资源的DNA条形码研究

9.3.2 中国云南与美洲辣椒属C.frutescens L.种质的特异性

9.3.3 中国部分辣椒资源辣椒素与二氢辣椒素含量遗传多样性

全文总结与建议

参考文献

致谢

攻读学位期间主要的研究成果

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