复合心肌组织工程联合大网膜移植术治疗心肌梗死的实验研究

论文摘要

第一部分可降解组织工程材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架的制备及评价目的：采用电纺丝技术制备新型可降解材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）三维立体支架；通过扫描电镜观察支架超微结构；进行体外力学、降解性能及细胞相容性评价；进行皮下包埋,评价其组织相容性；初步探讨其作为心肌组织工程支架应用的可行性。方法：1、PLGA三维支架的制备及超微观察：PLGA电纺丝使用PLGA（50/50）颗粒,以氯仿/DMF（体积比2：1）的混合溶液为溶剂,配成浓度分别为8%的溶液,溶液在室温下搅拌过夜。纺丝时将聚合物溶液倒入30ml玻璃注射器中,选用8#针头,纺丝电压为+10kV,接收距离为12cm,供料速率为3ml/h,接收装置为上覆铝箔的铜板。将获取的纺丝样品真空喷金后用扫描电镜观察其表面形貌,加速电压为20 kV。2、对PLGA纺丝布片进行缝合强度、断裂强度测试：将PLGA纺丝布片修剪成20mm×5mm的长方形（n=7）,然后将其一端夹在拉力机的夹具中,另一端用4#手术线与布片缝合在一起,测试其缝合强度；将PLGA布片修剪成工字形样条（n=8）,两端夹在拉力机的夹具中,测试范围长20mm,宽2mm,厚约0.5mm,进行断裂强度测试。3、PLGA纺丝布片的体外水解降解测试：将PLGA纺丝布片裁剪成尺寸约为10mm×10mm的正方形样片（n=3×4）,去污、蒸馏水冲洗、干燥后称重,然后放入6孔培养板内,加入PBS缓冲液完全浸润样片,放入37℃恒温箱内。在第1、2、4、6周之后将样片取出,用去离子水冲洗样片表面的盐离子,然后在室温下真空干燥至恒重,进行重量损失计算。4、PLGA纺丝布片的细胞相容性测试：以有机锡为稳定剂的聚氯乙烯（PVC）为阳性对照组,将收集到的PVC、PLGA膜片修剪成10×10mm大小,进行冲洗、消毒,按照膜片表面积；浸提递质=3 cm2：1ml的比例进行浸提液的制备。采用浸提液L929细胞培养MTT法进行细胞毒性测试、采用浸提液BrdU细胞增殖法观察细胞增殖情况、采用直接接触培养法进行细胞形态学观察。5、PLGA纺丝布片的体内组织相容性测试：将PLGA纺丝布片裁剪成尺寸约为10mm×10mm的样片（n=3×3）,建立大鼠皮下包埋模型,分别于术后1、2、4周取出材料,进行组织切片HE染色,观察材料变化情况。结果：1、PLGA纺丝布片丝形貌良好,尺寸较均匀,内部相互贯通,孔径约100-150微米不等,孔隙丰富,分布均匀,适于营养物质的交换及代谢产物的排出,能够满足种植细胞生长的需求。2、经体外力学测试PLGA电纺丝布片的缝合强度为（4.9+0.6）N,断裂拉伸强度为（1.6±0.3）MPa,可以满足心肌补片材料的力学要求。3、经重量损失计算发现PLGA纺丝布片在磷酸盐缓冲液中水解降解6周后,质量损失为13.4%,而且从第4周开始支架的降解速度加快,此外我们还观察到第8周时材料出现崩解,说明此PLGA支架具有可降解性。4、细胞毒性测试PLGA材料细胞毒性稳定在0-1级水平,对照组PVC组毒性稳定在4级水平,表明PLGA材料毒性较小,有利于细胞生长；应用BrdU细胞增殖法观察发现L929细胞从2-5天经历了4天的快速DNA合成期,增殖情况良好。细胞形态学观察显示L929细胞在PLGA膜片上呈梭形或三角形伸展,贴壁良好,生长旺盛,提示该材料细胞相容性良好,符合组织工程心肌支架材料的应用要求。5、大鼠皮下包埋术后标本切片观察支架材料符合慢性炎症反应过程,大鼠细胞向材料内部迁移、增殖,并沿纺丝纤维排列,第4周形成致密结构,组织相容性良好。结论：1、应用电纺丝技术制备的PLGA纺丝支架的微观形貌良好,满足心肌组织工程支架材料的几何要求；2、PLGA纺丝支架具有良好的缝合强度和抗拉强度,满足组织工程心肌支架材料的力学要求；3、PLGA纺丝支架具有可降解性,随着时间的延长,其降解速度加快；4、PLGA支架材料无明显细胞毒性,细胞在浸提液中的增殖良好,细胞形态学观察也证实该材料良好的细胞相容性；5、PLGA纺丝支架具有良好的组织相容性,体内置入未见明显炎症及排异反应,可安全得进行体内移植。第二部分复合组织工程联合大网膜移植术治疗心肌梗死的在体实验研究目的：缺血性心脏病具有很高的发病率和死亡率,心肌梗死后心肌细胞大量死亡,最终导致心力衰竭,对人类健康构成巨大威胁。内科药物治疗、冠脉介入及外科手术虽能改善症状,但均有不足。细胞移植是一种很有前途的针对缺血性心脏病的治疗手段,目前已有大量相关实验报道,目前的细胞治疗多采用注射方式,但其移植效率仍存在不足,急需寻找新的有效的治疗手段和方法。新兴的组织工程医学为我们提供了新的思路：通过体外构建出可降解PLGA三维立体支架,在体外将骨髓间充质干细胞种植于支架材料上构建出复合组织工程移植物进行心外补片治疗,提高细胞移植效率；针对移植后的血供缺陷,我们采用带蒂大网膜包裹术（OP）改善局部微环境,为移植物提供血运支持；通过建立大鼠心梗模型,评价上述治疗措施对心肌梗死治疗的疗效,为将来心肌组织工程的临床应用打下坚实的实验基础。方法：雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠MSCs采用全骨髓差速贴壁培养法进行分离、培养,选取生长旺盛的第3代细胞进行体外DAPI标记,种植于PLGA支架上体外培养4天。选择4周龄雌性SD大鼠,结扎左冠状动脉前降支制作大鼠心肌梗死（Myocardial infarction, MI）模型。心梗后1周,经胸心脏超声筛选左室射血分数（LVEF）小于60%同时左室缩短分数（LVFS）小于30%的心梗鼠进行随机分为4组,分别为MI对照组（n=10）、MSCs-PLGA组（n=12）、PLGA-OP组（n=12）及MSCs-PLGA-OP组（n=35）,进行二次开胸手术操作。MI对照组仅行二次开胸对照；MSCs-PLGA组单纯行工程材料心梗区心外膜补片移植；PLGA-OP组行无细胞种植的PLGA补片心外膜移植复合带蒂大网膜包裹术；MSCs-PLGA-OP组行工程材料移植复合带蒂大网膜包裹术。术后4周,应用超声心动图评价左心功能,标本取材做病理学检测（HE染色、免疫组化染色及免疫荧光染色）。另外,MSCs-PLGA-OP组分别于术后1、2周各处死9只观察MSCs随时间变化的存活情况。结果：术后各组大鼠存活状态良好,未见明显副作用发生。超声心动图检测显示,与MI对照组（49.85%±5.03%&22.06%±2.78%）相比,MSCs-PLGA-OP组（59.68%±5.78%&27.65%±3.81%）及MSCs-PLGA组（56.89%±7.57%&26.22±4.55%）的EF和FS均有改善（P< 0.05,ANOVA检测）,而PLGA-OP组（55.46%±3.75%&25.28%±2.22%）心功能虽有改善趋势,但无统计学意义；各组间的LVEDD和LVESD无统计学差异,说明PLGA纺丝支架富有弹性,未明显影响心脏的舒缩功能。MSCs-PLGA-OP组术后1、2、4周观察发现移植细胞随时间延长发生凋亡,但从2～4周细胞凋亡趋于稳定,说明大网膜已对移植细胞提供了足够的血供支持,免疫组化检测也证实了这一点；通过观察还发现第4周时已有MSCs向心梗区迁移,并有少量细胞向心肌方向分化。结论：通过体外构建种子细胞复合三维立体支架的组织工程移植物,联合大网膜包裹术能够提高细胞移植效率,改善心梗区局部微环境,进而改善心功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要术语、缩略词一览表
• 前言
• 第一部分 可降解组织工程材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架的制备及评价
• 研究背景
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 复合组织工程联合大网膜移植术治疗心肌梗死的在体实验研究
• 研究背景
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 组织工程心肌研究现状
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文论著