梅山×大白F1代与其亲本梅山猪背最长肌间差异表达基因的克隆鉴定及特征分析

论文摘要

骨骼肌是动物体内最丰富的组织，其生长发育相关性状是肉用家畜最重要的性状之一。两个具有不同遗传基础的亲本杂交产生的后代在生长发育和肌肉品质等方面往往超过其双亲，产生杂种优势现象。为了更好的解释和利用杂种优势，人们提出了很多假说，但是都不能很好的解释杂种优势现象。随着分子生物学的发展，人们已经认识到杂种优势是基因差异表达的结果。本研究以猪背最长肌为材料，利用抑制消减杂交技术构建了梅山猪及其杂交F1代梅大猪背最长肌间的正反向消减cDNA文库，进行了差异表达基因的筛选、克隆和鉴定，取得了如下结果：1、以猪管家基因G3PDH作为消减指标，对每个消减文库的消减效率进行了检测，结果表明2个消减文库的消减效率都达210倍以上，有的甚至高达215倍，这表明某些在梅山猪及其杂交F1代梅大猪背最长肌组织中的差异表达基因的富集效率也达210倍以上，说明所构建的消减cDNA文库质量很好。2、在每个文库中随机挑选了600多个克隆进行PCR鉴定。在以梅山猪为Tester、梅大猪为Driver和以梅大猪为Tester、梅山猪为Driver的消减cDNA文库中我们分别获得了591和632个有效阳性克隆，插入片段长度主要分布于150—750bp之间。3、利用斑点杂交技术，以正向消减cDNA、反向未消减cDNA为探针对2个消减cDNA文库中的阳性克隆进行了高通量筛选。在以梅山猪为Tester、梅大猪为Driver的消减cDNA文库中，我们选取了27个差异表达克隆进行分析，发现共代表14个ESTs，4个在猪中为已知基因，10个在猪中为未知基因（其中7个与人等其他物种的基因有高相似性，3个未找到明显的相似性）。在以梅大猪为Tester、梅山猪为Drivcr的消减cDNA文库中，我们选取了20个差异克隆进行分析，发现共代表11个ESTs，其中1个在猪中为已知基因，2个未找到明显的相似性，8个在猪中为未知基因，但分别与人等其他物种的基因有高的相似性。并利用含内标化的半定量RT-PCR对其中一些ESTs进行了验证，大部分为差异表达。4、将电子克隆、SMART技术和比较基因组学相结合，成功克隆了4个差异表达基因的全长和1个基因的编码区全长cDNA序列：①肌球蛋白轻链调控蛋白2（Myosin Regulatory Light Chain 2，MRLC2），GenBank登录号DQ490129，cDNA全长990bp，ORF为519bp；②造血干细胞因子117（Hematopoietic Stem／Progenitor Cells，HSPC117），GenBank登录号DQ508263，cDNA全长2015bp，ORF为1518bp；③（Bridging Integrator 1，BIN1），GenBank登录号EF117688，cDNA全长2001bp，ORF为1305bp；④Ras癌基因（H-Ras／N-Ras／K-Ras family，N-Ras），cDNA长986bp，ORF为570bp，GenBank登录号DQ325522；⑤肌肉磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，muscle form，PYGM），GenBank登录号DQ508264，cDNA全长2843bp，ORF为2529bp。其中MRLC2和HSPC117在梅山猪中表达量高于梅大猪，BIN1、N-Ras和PYGM在杂种F1代梅大猪中表达量较高。5、利用ORF Finder、GENSCAN、Signal P3.0、ProtParam、Prosite、MEGA等软件对猪MRLC2、HSPC117、、BIN1、N-Ras和PYGM基因的编码区、结构、蛋白质位点及其功能进行了分析，并构建了物种间系统进化树。6、利用半定量RT—PCR技术对所获得的差异表达基因进行了不同组织（背最长肌、脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、子宫、卵巢和睾丸）间的表达分析。7、利用比较基因组学和PCR技术，扩增了猪BIN1、N-Ras和PYGM等3个基因部分基因组序列，分析了其在不同猪种中的多态性，并在大白×梅山F2中与性状进行了相关分析，结果发现，猪肌肉磷酸化酶基因PYGM125位点AA基因型的活体瘦肉率比BB基因型高3％，肥肉率低5％，提示该位点可能是一个比较好的分子标记。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 杂种优势遗传机理研究进展
• 1.1 杂种优势的遗传假说
• 1.1.1 显性假说（Dominance Hypothesis）
• 1.1.2 超显性假说（Overdominance Hypothesis）
• 1.1.3 上位假说（Epistasis Hypothesis）
• 1.2 杂种优势遗传机理的研究进展
• 1.2.1 遗传距离（Genetic Distance）与杂种优势
• 1.2.2 数量性状位点（Quantitative Trait Locus,QTL）与杂种优势
• 1.2.3 基因组DNA甲基化（Genome Methylation）与杂种优势
• 1.2.4 基因表达调控（Gene Expression and Control）与杂种优势
• 2 基因差异表达的研究方法
• 3 抑制消减杂交（SUPPRESSION SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION,SSH）技术的研究进展
• 3.1 SSH的原理与方法
• 3.2 SSH的优点、不足和改进
• 3.2.1 SSH的优点
• 3.2.2 SSH的不足和改进
• 3.3 SSH的应用
• 4 获得cDNA全长方法的研究进展
• 4.1 RACE技术
• 4.1.1 RACE技术原理
• 4.1.2 RACE应用
• 4.2 电子克隆
• 4.2.1 电子克隆原理与方法
• 4.2.2 电子克隆应用
• 第二章 研究目的和意义
• 第三章 材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 构建cDNA消减文库组织样品
• 1.2 F2代猪群DNA样品及其性状测定
• 2 主要仪器与设备
• 3 主要试剂盒、药品试剂及其配置
• 3.1 主要试剂盒
• 3.2 主要药品和试剂
• 3.3 主要溶液的配制
• 4 实验方法
• 4.1 猪基因组DNA的提取、浓度测定和质量检测
• 4.2 肌肉组织总RNA的提取
• 4.3 背最长肌mRNA的分离
• 4.3.1 配制母液
• 4.3.2 探针退火
• 4.3.3 清洗磁珠
• 4.3.4 清洗与捕获Oligo（dT）-mRNA杂交体
• 4.3.5 洗脱mRNA
• 4.3.6 沉淀与浓缩mRNA
• 4.3.7 mRNA纯度与浓度的检测
• 4.4 SMART cDNA的合成
• 4.5 抑制消减杂交
• 4.5.1 Driver cDNA和Tester cDNA的制备
• 4.5.2 接头连接效率的检测
• 4.5.3 两轮抑制消减杂交
• 4.5.4 两轮PCR扩增
• 4.5.5 cDNA文库消减效率的检测
• 4.6 消减文库的构建
• 4.6.1 载体连接
• 4.6.2 细菌转化
• 4.7 消减cDNA文库的筛选
• 4.7.1 PCR初步筛选
• 4.7.2 斑点杂交筛选阳性克隆
• 4.8 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析
• 4.9 RT-PCR检验差异表达基因
• 4.9.1 背最长肌总RNA的提取
• 4.9.2 RT-PCR反应
• 4.10 差异基因全长cDNA克隆及序列分析
• 4.10.1 电子延伸
• 4.10.2 RACE-PCR
• 4.10.3 RACE-PCR产物的回收和纯化
• 4.10.4 克隆测序
• 4.10.5 序列分析
• 4.11 差异基因组织表达谱分析
• 4.11.1 RNA的制备
• 4.11.2 RT-PCR反应
• 4.12 差异表达基因的多态性分析和SNP研究
• 第四章 结果与分析
• 1 背最长肌总RNA的提取
• 2 SMART cDNA的合成
• 3 抑制消减杂交
• 3.1 Driver cDNA和Tester cDNA的制备
• 4 消减cDNA文库的构建和筛选
• 4.1 消减cDNA文库的构建和PCR初步筛选
• 4.2 斑点杂交筛选文库
• 4.3 差异表达克隆测序及序列分析
• 5 差异表达基因的克隆、序列分析、组织表达谱分析及SNP研究
• 5.1 MS341（Myosin Regulatory Light Chain 2,MRLC2）
• 5.1.1 MS341差异表达RT—PCR验证
• 5.1.2 MS341基因全长cDNA的克隆
• 5.1.3 MS341基因的序列分析
• 5.1.4 猪MRLC2基因的组织表达谱分析
• 5.2 MS556（Hematopoietic Stem/Progenitor Cells,HSPC117）
• 5.2.1 MS556差异表达RT—PCR验证
• 5.2.2 MS556基因全长cDNA的克隆
• 5.2.3 MS556基因的序列分析
• 5.2.4 猪HSPC117基因的组织表达谱分析
• 5.2.5 猪HSPC117基因cDNA SNP分析
• 5.3 MD574（Bridging Integrator 1,BIN1）
• 5.3.1 MD574差异表达RT—PCR验证
• 5.3.2 MD574基因全长cDNA的克隆
• 5.3.3 MD574基因的序列分析
• 5.3.4 猪BIN1基因的组织表达谱分析
• 5.3.5 猪BIN1部分基因组的克隆和SNP研究
• 5.4 MD332（H-Ras/N-Ras/K-Ras family,N-Ras）
• 5.4.1 MD332差异表达RT—PCR验证
• 5.4.2 MD332基因cDNA的克隆
• 5.4.3 MD332基因的序列分析
• 5.4.4 猪N-RAS基因的组织表达谱分析
• 5.4.5 猪N-RAS部分基因组的克隆和SNP研究
• 5.5 MD349（Glycogen phosphorylase,muscle form,PYGM）
• 5.5.1 MD349差异表达RT—PCR验证
• 5.5.2 MD349基因全长cDNA的克隆
• 5.5.3 MD349基因的序列分析
• 5.5.4 猪PYGM基因的组织表达谱分析
• 5.5.5 猪PYGM部分基因组的克隆和SNP研究
• 第五章 讨论
• 1 关于抑制消减杂交技术
• 2 关于斑点杂交筛选差异表达EST
• 3 关于半定量RT-PCR
• 4 关于EST的电子克隆和RACE技术
• 5 关于差异表达基因
• 5.1 MRLC2（Myosin Regulatory Light Chain 2）
• 5.2 HSPC117（Hematopoietic Stem/Progenitor Cells,HSPC117）
• 5.3 BIN1（Bridging Integrator 1,BIN1）
• 5.4 Ras（H-Ras/N-Ras/K-Ras family,N-Ras）
• 5.5 PYGM（Glycogen phosphorylase,muscle form,PYGM）
• 5.6 关于SNPs的遗传效应
• 5.7 关于下一步的工作
• 小结
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢