论文摘要
Cyt-c是一类水溶性蛋白,是由核基因编码合成,依附在线粒体内膜表面。Cyt-c作为一种载体,在呼吸链电子传递过程起重要作用。一旦Cyt-c功能出现障碍或是Cyt-c缺失,将会致使呼吸链功能出现异常,进而引起ATP缺乏,最终使细胞出现死亡。此外,Cyt-c由线粒体释放至细胞质也是线粒体介导凋亡信号转导的最重要事件,即通过caspase等途径诱导细胞凋亡。尽管在哺乳动物细胞凋亡研究中已经证实Cyt-c能由线粒体释放至细胞质进而影响细胞凋亡,但昆虫细胞凋亡中是否也存在同样的途径并不没完全阐明。在双翅目昆虫细胞凋亡研究中,关于Cyt-c的作用存在一些不同结果。到目前为止,普遍性认为Cyt-c不会从线粒体释放至细胞质,caspase的活化与细胞凋亡也不依靠细胞Cyt-c o然而,鳞翅目昆虫细胞凋亡的研究结果却与双翅目体系相反的结论。如：利用2-dexory-D-ribose诱导舞毒蛾IPLB-LdFB细胞的细胞凋亡,发现了Cyt-c的释放和caspase-3的活性；紫外线诱导Sf9细胞凋亡,Western杂交检测到Cyt-c由线粒体释放至细胞质,且能激活相关的凋亡蛋白。同时,杆状病毒P35基因的表达会抑制Cyt-c从线粒体释放出来。本实验室利用杆状病毒处理鳞翅目斜纹夜蛾SL-1细胞,Cyt-c会由线粒体释放至细胞质中,且能激活caspase-3的活化。但是这些研究主要建立在western杂交上需要利用其他方法验证。本实验室已利用RNAi技术研究Cyt-c在SL-1细胞凋亡体系的作用。研究发现,利用RNAi沉默SL-1细胞的Cyt-c表达后,再经杆状病毒处理细胞,Cyt-c的mRNA水平降低、caspase-3的活性有所降低等。在前期的研究基础之上,我们继续采用RNAi技术进一步研究Cyt-c在鳞翅目昆虫细胞凋亡中作用。利用体外转录的方法,合成相应的dsRNA;用双染（Annexin V-FITC和PI）对经RNAi处理的细胞进行细胞凋亡率的检测；经RNAi干扰,病毒诱导凋亡细胞后,分析caspas-9的活性等。从形态上,利用显微镜观察经DAPI染色的细胞,我们可以发现RNAi沉默Cyt-c的表达,细胞凋亡数量减少,凋亡小体和半月牙变少等。同时,不同时间段（24h、48h和72h）转染dsRNA,应用DNA电泳检测发现转染Cyt-c dsRNA的细胞DNA片段化程度相对较低。采用Annexin V-FITC和PI对处理细胞进行双染色。流式细胞仪检测到转染eGFP dsRNA48h、Cyt-c dsRNA48h然后接种病毒和只加病毒处理的细胞凋亡率分别约为67.49%、51.88%和63.2%。利用caspase-9的特异性底物与提取蛋白反应后,荧光分光光度计测值。正常细胞的caspase-9值很低。转染eGFP dsRNA48h、Cyt-c dsRNA48h然后接种病毒和只加病毒处理的caspase-9活性约分别为108.3、72和102.3。显然,沉默细胞色素的表达抑制caspase-9活性说明caspase-9活性是细胞色素C依赖性的,这是鳞翅目昆虫凋亡细胞中首次关于细胞色素C与caspase-9关系的报道。通过显微镜形态观察、DNA电泳、流式细胞仪检测和caspase-9活性的测定结果,我们可以初步断定Cyt-c在AfMNPV诱导的鳞翅目昆虫细胞SL-1细胞凋亡具有重要作用。因此,我们认为细胞色素C在哺乳动物和鳞翅目昆虫细胞凋亡中具有相似的功能。