人重组Tg检测TgAb间接ELISA法的建立及其初步临床应用

论文摘要

自身免疫性甲状腺疾病（AITD）是临床常见病,由一组由于免疫系统自身攻击引起的疾病组成,它包括桥本甲状腺炎（Hashimoto disease,HT）、Graves病（Graves disease,GD）和特发性甲状腺功能减退症。人甲状腺球蛋白（Thyroglobulin,Tg）产生的自身抗体（TgAb）是反映AITD患者免疫状态的常用指标之一。迄今为止,国内外所用测定TgAb的方法中,Tg抗原多提取自人甲状腺组织,来源相对受限,还难免混杂其它蛋白杂质,目前尚少有使用重组hTg为抗原建立检测方法的相关报道。目的:利用分子生物学技术在原核系统表达hTg抗原决定簇片段（1491bp）,获得hTg抗原决定簇基因融合蛋白（简称为重组hTg蛋白）。以该基因工程产品为抗原,建立检测TgAb的间接ELISA方法,鉴定后用于临床检测300例正常人血清标本,确定正常切限值,检测5种甲状腺疾病患者血清（共484例）,计算其TgAb水平的统计学差异及其阳性检出率。方法:从宿主菌Ecoli TOP10中提取出含有hTg抗原决定簇基因的原核表达型质粒pET102/D-TOPO,将其转化入表达菌E.coli BL21 StarTM（DE3）,异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thioglactoside,IPTG）终浓度为1.0 mM、25℃、6h进行诱导表达,超声波碎菌,碎菌上清经Ni-NTA His·Bind树脂亲和层析纯化,获得重组hTg,用SDS-PAGE、ELISA法分别检测重组蛋白的分子量和免疫活性,用考马斯亮蓝染色法定量。以纯化后的重组hTg为抗原建立ELISA法,重组抗原和待测血清最佳工作浓度的确定采用交叉连续稀释法。测定批内变异系数（批内CV）和批间CV。用所建立的ELISA法和临床上常用的以提取全长hTg为抗原的RIA法分别检测30例血清标本进行相关性分析。测定300例健康体检者,确立正常界限值,然后分别检测5种甲状腺疾病患者484例:桥本甲状腺炎（HT）219例,Graves病212例（初诊121例、复诊91例）,亚急性甲状腺炎（SAT）19例,结节性甲状腺肿20例,单纯性甲状腺肿14例。所得数据用SPSS 12.0统计软件进行分析,数据比较行t检验及方差分析,率的比较用卡方检验。结果:1、从宿主菌E.coli TOP10中提取出原核表达型质粒pET102/D-TOPO,PCR鉴定目的基因无误。重组hTg表达产率为3.3 mg/L。分子量测定为72.68 kD,与理论值70.8kD相差2.66%,ELISA法确定产物有免疫活性。2、当包被抗原量1μg/孔,一抗1:50倍稀释,碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG为1:20000,显色条件为37℃60min时,阳性血清与阴性血清的A值差距最大,为3.291(以阳性A405/阴性A405值＞2.1为基本条件),故选作最佳条件。用此ELISA法与RIA法比较呈正相关（相关系数r=0.899,P＜0.01）。阳性与阴性质控血清批内CV分别是4.3%和4.7%;批间CV分别是4.7%和12.2%。3、临床检测结果:（1）ELISA检测300份健康体检者血清,TgAb值在各年龄组间差异无统计学意义（F=0.655,P＞0.05）,在性别间差异也无统计学意义（t=1.68,P＞0.05）,故合并为正常对照组,A405值（?）±s为0.404±0.173,阳性切值是0.74。（2）GD初诊和GD复诊患者血清TgAb含量差异无统计学意义（t=0.690,P＞0.05）,故合并为GD组。（3）HT组TgAb含量显著高于GD组（t=11.171,P＜0.01）、结节性甲状腺肿（t=14.886,P＜0.01）、单纯性甲状腺肿（t=15.984,P＜0.01）、SAT（t=12.936,P＜0.01）和正常对照组（t=18.728,P＜0.01）;GD组TgAb含量显著高于结节性甲状腺肿（t=3.409,P＜0.01）、单纯性甲状腺肿（t=3.606,P＜0.01）和正常对照组（t=4.775,P＜0.01）;SAT组hTg含量高于正常对照组（t=2.051,P＜0.05）,其余组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。（4）HT、GD初诊、GD复诊、SAT、结节性甲状腺肿、单纯性甲状腺肿患者的阳性检出率分别为70.8%、38.8%、28.6%、5.3%、5.0%、0。合组后的GD组阳性检出率为34.4%。其中,HT组阳性检出率分别显著高于其他5组（P＜0.01）。GD初诊组除稍高于GD复诊组（P＞0.05）外,分别明显高于结节性甲状腺肿（P＜0.01）、单纯性甲状腺肿（P＜0.05）或SAT组（P＜0.01）。GD复诊组分别明显高于结节性甲状腺肿、单纯性甲状腺肿或SAT组（P＜0.05）。结节性甲状腺肿、单纯性甲状腺肿或SAT三组间两两比较差异均不显著（P＞0.05）。结论:1、在原核系统中成功表达hTg重组蛋白,产物具有免疫活性;2、成功建立了以重组hTg为抗原检测TgAb的ELISA法,与RIA法存在显著相关;3、用此ELISA法测定784份血清,结果提示此法可用于临床检测甲状腺疾病。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 技术路线示意图
• 前言
• 一 甲状腺球蛋白抗原决定簇基因在大肠杆菌中的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 二 重组甲状腺球蛋白检测TgAb间接ELISA法的建立及其临床初步应用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况
• 综述
• 综述正文
• 综述参考文献
• 致谢