巨大芽孢杆菌β-甘露聚糖酶生产工艺和酶学性质的研究

论文摘要

本论文主要对巨大芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的摇瓶发酵工艺、发酵罐发酵工艺、β-甘露聚糖酶的酶学性质,甘露聚糖酶的作用方式及酶解能力等几个方面进行了研究。通过摇瓶工艺优化,在LB培养基（OXOID,四环素浓度为10μg/mL）、pH值7.0、摇瓶装液量为50 ml（500 ml三角瓶）、菌种活化后以2%的接种量转种、1h后添加0.75%诱导剂、温度为37℃、摇床转速为200 r/min等条件下培养24h,β-甘露聚糖酶的酶活力可达到200,000 U/ml。在50L全自动发酵罐上,以工业生产级LB培养基来生产β-甘露聚糖酶。装液量、培养温度、罐压、起始pH和转速分别为35L、37℃、0.04 MPa、6.8～7.0和120r/min。培养1h后添加0.75%诱导剂,待菌体进入对数生长期以后,维持溶氧值30%～35%,并按一定速度缓慢流加2 L A溶液,20 h后甘露聚糖酶活力最高达到220,000 U/ml。该工艺在250 L发酵罐条件下也得到较好验证。用微滤和超滤设备对发酵液进行纯化和浓缩,浓缩后的酶活达到1,450,000U/ml,达到工业酶制剂的要求。通过（NH4）2SO4沉淀、透析和超滤离心,对β-该甘露聚糖酶进行纯化。初步研究表明,该酶分子量为39 KD,最适反应pH值为7.0,在pH值6.0～10.0之间能保持大部分活性,属于中性偏碱性酶,最适的反应温度为50℃,50℃以下能保持良好的稳定性。金属离子对该酶的影响不大,只有Mn2+和Fe2+有较明显的抑制作用,Ca2+对该酶活性有微弱的增强作用。实验结果表明该β-甘露聚糖酶为诱导型内切酶,向每克魔芋精粉添加4000个酶单位,6 h后可将10%的魔芋精粉水解成平均小于四个单糖的寡糖。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 β-甘露聚糖概述
• 1.1.1 β-甘露聚糖的结构和组成
• 1.1.2 β-甘露聚糖的抗营养作用
• 1.2 β-甘露聚糖酶的研究进展
• 1.2.1 β-甘露聚糖酶的来源
• 1.2.2 β-甘露聚糖酶的生物学特性
• 1.2.3 β-甘露聚糖酶活力分析
• 1.2.4 β-甘露聚糖酶的水解产物
• 1.2.5 β-甘露聚糖酶的用途
• 1.2.6 β-甘露聚糖酶的发展状况
• 1.3 甘露低聚糖简介
• 1.3.1 甘露低聚糖的来源
• 1.3.2 甘露低聚糖的功能
• 1.3.3 魔芋甘露低聚糖
• 1.3.4 低聚糖的生产现状
• 1.4 用芽孢杆菌作宿主细胞的原因
• 1.4.1 芽孢杆菌表达外源蛋白的优势
• 1.4.2 芽孢杆菌外源蛋白的表达
• 1.4.3 巨大芽孢杆菌蛋白表达系统
• 1.5 本课题研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 仪器
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 酶液的制备
• 2.2.2 酶活检测方法
• 2.2.3 进口原材料LB培养基产酶发酵工艺的优化
• 2.2.4 国产原材料对产酶发酵工艺的影响
• 2.2.5 甘露聚糖酶发酵罐工艺的研究
• 2.2.6 甘露聚糖酶的纯化
• 2.2.7 β-甘露聚糖酶的酶学性质
• 2.2.8 β-甘露聚糖酶水解能力的研究
• 第三章 结果与分析
• 3.1 进口原材料LB培养基产酶发酵工艺的优化
• 3.1.1 转种量对菌种产酶的影响
• 3.1.2 不同诱导时间对菌种产酶的影响
• 3.1.3 诱导剂浓度对菌种产酶的影响
• 3.1.4 四环素浓度对菌种产酶的影响
• 3.1.5 摇瓶装量对菌种产酶的影响
• 3.1.6 培养基起始pH值对菌种产酶的影响
• 3.2 国产原材料对产酶发酵工艺的影响
• 3.2.1 进口原材料培养基与国产原材料培养基的产酶对比
• 3.2.2 国产原材料各单因素对产酶的影响
• 3.2.3 不同来源的国产蛋白胨对菌种产酶的影响
• 3.3 甘露聚糖酶发酵罐生产工艺的研究
• 3.3.1 50L发酵罐工艺的研究
• 3.3.2 250L发酵罐工艺的研究
• 3.3.3 发酵酶液的分离纯化
• 3.4 β-甘露聚糖酶的纯化
• 4）₂SO₄分级沉淀区域的选择'>3.4.1（NH₄）₂SO₄分级沉淀区域的选择
• 3.4.2 β-甘露聚糖酶的纯化
• 3.4.3 SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.5 β-甘露聚糖酶的酶学性质
• 3.5.1 pH值对β-甘露聚糖酶活性的影响
• 3.5.2 温度对β-甘露聚糖酶活性的影响
• 3.5.3 pH值对β-甘露聚糖酶稳定性的影响
• 3.5.4 温度对β-甘露聚糖酶稳定性的影响
• 3.5.5 金属离子对β-甘露聚糖酶活性的影响
• 3.6 β-甘露聚糖酶水解能力的研究
• 3.6.1 β-甘露聚糖酶水解魔芋精粉
• 3.6.2 酶解糖液后处理
• 3.6.3 酶解产物分析
• 第四章 小结与讨论
• 4.1 β-甘露聚糖酶摇瓶发酵工艺研究
• 4.2 β-甘露聚糖酶发酵罐发酵工艺研究
• 4.3 β-甘露聚糖酶分离纯化工艺研究
• 4.4 β-甘露聚糖酶酶学性质研究
• 4.5 β-甘露聚糖酶水解能力的研究
• 4.6 总论
• 参考文献
• 附录
• 致谢