产茴香醛菌株Burkholderia WGB30的鉴定及其部分代谢产物的分析

论文摘要

茴香醛是一种重要的有机中间体,它具有持久的山楂香气和较强的抗氧化性能,广泛应用于食品、医药及日用化学工业。目前茴香醛产品主要是通过化学法制备,存在严重弊端,新开发的电氧化工艺和臭氧化工艺,虽在环境问题上得到了极大改善,但反应条件苛刻、设备要求高,工业化困难。因此,寻求一条经济有效、环境友好的茴香醛制备途径是一个值得研究的课题。本研究以八角茴香油为原料,通过富集培养和分离纯化,从八角环境中筛选到320株能以反式茴脑作为唯一碳源的菌株,经薄层层析法、紫外分光光度法和气相色谱法相结合对转化液进行分析,结果获得一株相对高产茴香醛的细菌菌株WGB30,茴香醛的摩尔转化率达5.08%。经形态学、生理生化实验、Biolog EcoPlates鉴定以及16SrDNA序列同源性分析,初步鉴定菌株WGB30为伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp.。试验探讨了培养基主要组成、培养条件（起始pH、温度、装液量、转速和转化时间）、种子生长时间、生物量、乳化剂以及底物的添加时间和添加量对菌株WGB30生成茴香醛能力的影响。通过单因素试验和正交试验得出菌株WGB30生成茴香醛的最佳培养基主要组成为：葡萄糖20g/L,蛋白胨8g/L；最佳培养条件为：初始pH6.5,培养温度28℃,装液量60ml/250ml,转速180rmp,转化时间3d；在上述发酵条件下,茴香醛的摩尔生成率可达11.42%,约为优化前的2倍。采用气相色谱-质谱联用仪分析Burkholderia WGB30转化反式茴脑的代谢产物,结果获得三种产物,分别为茴香醛、茴香酸和N-甲基对甲苯胺,并对Burkholderia WGB30代谢反式茴脑途径进行了初步的推测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 八角茴香的研究概况
• 1.2 八角茴香油
• 1.3 八角茴香（Illicium verum）的化学成分
• 1.3.1 挥发性化合物
• 1.3.2 倍半萜内酯及其衍生物
• 1.3.3 黄酮类成分
• 1.3.4 苯丙烷和木脂素类
• 1.3.5 其它
• 1.4 八角茴香的药用价值
• 1.4.1 抑菌作用
• 1.4.2 升高白细胞作用
• 1.4.3 镇痛作用
• 1.4.4 抗氧化性
• 1.4.5 杀虫作用
• 1.4.6 其它作用
• 1.5 茴香醛
• 1.5.1 理化性质
• 1.5.2 茴香醛的应用
• 1.6 茴香醛制备工艺的研究进展
• 1.6.1 茴香脑氧化法
• 1.6.2 基础化工原料法
• 1.7 生物技术在香料中的研究进展
• 1.8 微生物代谢茴香脑的研究进展
• 1.9 检测方法的分析
• 1.9.1 气相色谱法
• 1.9.2 薄层层析法
• 1.9.3 紫外分光光度法
• 1.9.4 其他方法
• 1.10 立题背景和意义
• 1.11 研究的主要内容及技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 样品来源
• 2.2 培养基、培养条件及菌种保存
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 培养条件
• 2.2.3 菌种保存
• 2.3 主要药品及仪器
• 2.4 溶液、缓冲液和试剂
• 2.5 检测方法的建立
• 2.5.1 紫外分光光度法
• 2.5.2 薄层色谱法
• 2.5.3 气相色谱法
• 2.6 样品的富集培养
• 2.7 菌株的分离纯化及筛选
• 2.7.1 初筛
• 2.7.2 复筛
• 2.8 目的菌株的鉴定
• 2.8.1 形态学观察
• 2.8.2 生理生化鉴定
• 2.8.3 Biolog鉴定
• 2.8.4 16SrDNA鉴定
• 2.9 目的菌株转化茴脑产茴香醛的条件优化
• 2.9.1 菌体生物量的测定
• 2.9.2 底物和产物浓度的测定
• 2.10 菌株耐受茴香脑及茴香醛分析
• 2.11 菌株的诱变育种
• 2.11.1 紫外诱变
• 2.11.2 微波诱变
• 2.11.3 亚硝酸诱变
• 第三章 产茴香醛菌株的筛选
• 3.1 发酵液预处理的方法研究
• 3.2 菌株的筛选
• 3.2.1 以茴香脑为唯一碳源的菌株筛选
• 3.2.2 可耐受高浓度茴香脑的菌株筛选
• 3.2.3 能够转化茴脑并积累茴香醛的菌株筛选
• 3.3 实验菌株WGB30的鉴定
• 3.3.1 形态学及培养特征
• 3.3.2 生理生化实验
• 3.3.3 Biolog鉴定
• 3.3.4 16SrDNA的鉴定
• 3.3.5 16SrDNA PCR产物的测序分析
• 3.4 菌株WGB30耐受反式茴香脑的分析
• 第四章 菌株WGB30转化茴脑产茴香醛的条件优化
• 4.1 碳源选择
• 4.1.1 不同碳源对菌体增殖的效果
• 4.1.2 葡萄糖浓度的确定
• 4.2 氮源选择
• 4.2.1 不同氮源对生长和转化的影响
• 4.2.2 最佳蛋白胨浓度的选择
• 4.3 培养条件对生长和转化的影响
• 4.3.1 初始pH
• 4.3.2 温度
• 4.3.3 装液量
• 4.3.4 发酵时间
• 4.3.5 转速
• 4.4 影响转化的其他因素
• 4.4.1 种子生长时间的确定
• 4.4.2 生物量
• 4.4.3 乳化剂对转化影响
• 4.5 添加茴脑的研究
• 4.5.1 茴脑的添加时间
• 4.5.2 茴脑的添加量
• 4.6 正交试验
• 4.7 验证试验
• 4.8 诱变育种
• 第五章 菌株WGB30代谢茴香脑的途径分析
• 5.1 菌株WGB30在不同碳源培养基的生长比较
• 5.2 菌株WGB30对茴脑的耐受分析
• 5.3 菌株WGB30对茴香醛的耐受及代谢分析
• 5.4 菌株WGB30转化茴香脑的GC-MS检测
• 5.5 HRMS鉴定代谢产物
• 5.6 代谢茴香脑的途径分析
• 第六章 结果与讨论
• 6.1 结果
• 6.2 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文