西瓜噬酸菌致病相关基因hisA及hisC的功能研究

论文摘要

西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli, Ac）是近年来发生在西瓜、甜瓜等葫芦科植物上的一种重要病原细菌。它主要危害西瓜、甜瓜,引起叶斑或叶枯,造成果实腐烂,严重时导致绝产。目前人们对瓜类细菌性果斑病的研究多侧重于鉴定、生物学特性、病害发生规律等方面,对于其致病机理及致病相关基因的研究却很少。因此,西瓜噬酸菌的致病相关基因及其致病机理的研究对于病害防治致关重要。本实验室利用Mini-Tn5转座子随机插入的方法,成功构建了野生型xjl12的突变体文库,并筛选到1株在烟草上不能激发过敏性反应而且对哈密瓜致病性降低的突变体。通过亚克隆技术鉴定了转座子的插入位点,确定其为hisC （histidinol-phosphate aminotransferase）基因的突变体。由hisC基因编码的磷酸组胺醇氨基转移酶（HPA）作为组氨酸合成酶的1种,催化组氨酸合成反应的第七步。本研究利用双交换同源重组的原理构建了hisC基因的突变体,并对其功能进行分析。组氨酸是生物体蛋白质合成的必需氨基酸,其生物合成途径已得到广泛的鉴定。在西瓜噬酸菌中,his基因簇包括9个基因,按其参与组氨酸合成反应的先后顺序分别为hisG、hisE、hisI、hisA、hisF, hisH、hisB、hisC、hisD。到目前为止很少有关于his基因在西瓜噬酸菌中的报道。致病性发生变化可能由多方面的原因引起,组氨酸作为生物体的1种必须氨基酸,如果其合成过程中的某个酶被破坏,西瓜噬酸菌的致病性是否也会受到影响。鉴于hisC基因与Ac的致病性之间的密切关系,为了进一步验证组氨酸的合成缺陷与Ac的致病性之间的关系,我们也对Ac中组氨酸合成过程中的另外1个酶——磷酸核糖亚氨甲基-5-氨基咪唑-甲酰氨核糖核苷酸异构酶进行了功能研究。此酶由hisA基因编码,本研究利用单交换同源重组的原理构建了hisA基因插入突变体,并对其功能进行了初步研究。结果表明：这些基因突变后均丧失了激发烟草过敏性反应的能力,致病性明显下降,发病时间比野生型延迟了约48h,通过外源添加组氨酸可恢复其突变特征,证实了这些基因的突变所致性状改变与组氨酸的合成缺陷直接相关,初步探索了his基因在Ac中的功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 瓜类细菌性果斑病研究进展
• 1 病原特性
• 2 症状识别
• 3 入侵途径
• 4 致病力的研究现状
• 5 防治措施
• 6 组氨酸生物合成途径
• 7 组氨酸营养缺陷型
• 第二部分 研究内容
• 第一章 西瓜噬酸菌致病相关基因hisC的功能研究
• 1 试验材料
• 1.1 供试菌株和质粒
• 1.2 培养基及抗生素
• 1.3 引物
• 1.4 试剂
• 2 试验方法
• 2.1 细菌基因组DNA的提取
• 2.2 PCR扩增及产物回收
• 2.3 质粒的提取
• 2.4 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算
• 2.5 大肠杆菌热击感受态的制备和转化
• 2.6 Southern杂交
• 2.7 突变株的构建
• 2.8 互补菌株的构建
• 2.9 在MMX培养基中的生长测定
• 2.10 外源添加不同氮源的菌体生长恢复情况
• 2.11 外源添加植物组织提取液的菌体生长恢复情况
• 2.12 致病性、过敏性反应测定及外源添加组氨酸的恢复情况
• 2.13 突变体HCM在寄主组织中菌体生长能力的测定
• 2.14 胞外纤维素酶的检测
• 2.15 游动性和趋化性应答实验
• 3 结果和分析
• 3.1 重组质粒pEXLKR的酶切验证
• 3.2 突变株的验证
• 3.3 互补菌株的验证
• 3.4 hisC基因的突变影响西瓜噬酸菌的正常生长
• 3.5 外源添加组氨酸和蛋白胨可恢复突变体的生长
• 3.6 外源添加植物组织提取液可恢复突变体的生长
• 3.7 hisC基因的突变延缓了西瓜噬酸菌的致病时间并丧失了烟草过敏性反应,外源添加组氨酸可恢复其致病性及烟草过敏性反应
• 3.8 hisC基因的突变影响西瓜噬酸菌在寄主组织中的生长
• 3.9 hisC基因的突变不影响西瓜噬酸菌胞外纤维素酶的产生
• 3.10 hisC基因的突变不影响西瓜噬酸菌的游动性和趋化性
• 4 讨论
• 第二章 西瓜噬酸菌致病相关基因hisA的功能研究
• 1 试验材料
• 1.1 供试菌株和质粒
• 1.2 培养基及抗生素
• 1.3 引物
• 1.4 试剂
• 2 试验方法
• 2.1 细菌基因组DNA的提取
• 2.2 PCR扩增及产物回收
• 2.3 质粒的提取
• 2.4 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算
• 2.5 大肠杆菌热击感受态的制备和转化
• 2.6 Southern杂交
• 2.7 突变株的构建
• 2.8 互补菌株的构建
• 2.9 在MMX培养基中的生长测定
• 2.10 外源添加不同氮源的菌体生长恢复情况
• 2.11 外源添加植物组织提取液的菌体生长恢复情况
• 2.12 致病性、过敏性反应测定及外源添加组氨酸的恢复情况
• 2.13 在寄主组织中HCM的菌体生长能力测定
• 2.14 胞外纤维素酶的检测
• 2.15 游动性测定
• 3 结果和分析
• 3.1 自杀重组载体pⅥ-S12的验证
• 3.2 突变体的验证
• 3.3 互补菌株的验证
• 3.4 hisA基因的突变影响西瓜噬酸菌的正常生长
• 3.5 外源添加组氨酸和蛋白胨可恢复突变体的生长
• 3.6 外源添加植物组织提取液可恢复突变体的生长
• 3.7 hisA基因的突变延缓了西瓜噬酸菌的致病时间并丧失了烟草过敏性反应,外源添加组氨酸可恢复其致病性及烟草过敏性反应
• 3.8 hisA基因的突变影响西瓜噬酸菌在寄主组织中的生长
• 3.9 hisA基因的突变不影响西瓜噬酸菌胞外纤维素酶的产生
• 3.10 hisA基因的突变不影响西瓜噬酸菌的游动性
• 4 讨论
• 附录
• 参考文献
• 致谢