论文题目: 胚胎干细胞同步化处理、神经分化及Aβ对分化神经元NFκB通路的影响
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物医学工程
作者: 章恩明
导师: 郑筱祥
关键词: 胚胎干细胞,神经元,分化,胚体,细胞同步化,碱性成纤维生长因子,阿尔茨海默症,淀粉样蛋白,核因子
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 胚胎干细胞(ESC)诱导分化为神经细胞的体外模型类似早期的胚胎发育模式,利用此模型,辅之以分子生物学、细胞生物学及免疫学等技术手段,可以有效进行神经发生分化及一些遗传性神经致病机制的研究。胚体(EBs)是ESC分化前形成的团聚体,在ESC神经分化过程中具有承前启后的作用,EBs内细胞的周期状态与诱导分化的关系未见报道。无血清培养方法诱导神经分化过程中,碱性成纤维生长因子(bFGF)是EBs贴壁后诱导分化阶段必须添加的生长因子,bFGF可能在ESC神经诱导分化阶段发挥神经营养作用,但由于bFGF能触发体外培养的皮层神经元释放兴奋性递质谷氨酸(Glu),故也可能在神经诱导分化阶段发挥神经刺激兴奋性的作用。利用ESC诱导分化为神经细胞的体外模型可以从神经发育学的角度分析阿尔茨海默症(AD)的发生机制,尤其是神经元从分化发生到凋亡或死亡的发育模式,为我们在体外研究β-淀粉样蛋白(Aβ)对不同年龄阶段神经元的影响提供了可能。 首先,建立了基于本实验室条件下的ESC诱导分化神经元细胞方法体系。我们在Bain“4+/4-”RA诱导法的基础上,对小鼠D3系ESC采用“2+2”(即悬滴培养2天再悬浮培养两天)的培养方式形成EBs,全反式维甲酸(RA)诱导的ESC在体外分化为神经元样细胞,并初步分析了ESC诱导分化的神经元细胞生物学特性。结果发现,我们诱导ESC分化产生了谷氨酸能的神经元细胞,通过RT-PCR分析鉴定,这类神经元细胞表达了NMDA受体亚型;使用荧光分子探针标记发现,分化的神经元细胞能够被Glu刺激后开放NMDA受体通道,使胞内钙离子浓度升高,并被NMDA受体拮抗剂MK801阻断。 其次,通过探索不同周期时相ESC对EBs形成的影响、不同增殖状态ESC对神经分化的影响等,确立ESC的细胞周期状态与EBs的结构形成的关系,发现血清饥饿同步化可以增强EBs的分化潜能性。通过血清饥饿、脱氧胸苷和秋水仙素阻断法分别有效地将ESC阻断在G0/G1、G1/S、G2/M相,研究了同步化后的细
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中文摘要
ABSTRACT
第一章 绪言
一、ESC的生物学基础
(一) 干细胞与胚胎干细胞
(二) ESC生物学特征
(三) ESC的细胞增殖与生长
二、ESC的胚胎发育学基础
(一) ESC的发育、决定及分化
(二) ESC分化的调控
(三) ESC诱导分化
(四) 细胞周期与ESC分化
三、ESC定向神经分化的神经发育学基础
(一) 体内诱导神经发生
(二) 来源于ESC体外诱导神经发生
(三) 外界因子与神经分化诱导
四、ESC定向诱导分化为神经细胞的研究现状
(一) RA诱导ESC分化神经细胞
(二) 无血清株系选择法诱导ESC分化神经细胞
(三) 基因修饰法诱导ESC分化神经细胞
五、Aβ、NFkB信号通路与AD治疗的研究现状
(一) Aβ代谢与AD病理机制
(二)Aβ与神经元毒害：NFkB信号通路激活理论
(三) NFKB信号通路调控与AD治疗
六、本研究的目的意义
(一) ESC的细胞周期与神经诱导分化
(二) bFGF在ESC神经分化中的作用
(三) Aβ与ESC分化的神经元细胞中NFkB通路的活化
第二章 胚胎干细胞定向诱导分化神经细胞
一、前言
二、材料与方法
(一) 试剂与材料
(二) ESC分化培养
(三) 免疫细胞化学检测
(四) RT-PCR分析
(五) 细胞内钙离子检测
三、实验结果
(一) ESC体外分化的形态特征
实验结果表明，EBs的形成和RA处理是体外诱导神经细胞分化较为关键的
(二) 分化神经细胞的神经特异抗原的表达
(三) 分化神经细胞NMDA受体亚型的表达
(四) 分化神经细胞Glu刺激兴奋性特征
四、讨论
第三章 细胞周期同步化对EBS分化潜能性的影响
一、前言
二、方法与材料
(一) 试剂与材料
(二) ESC的培养
(三) EBs的形成
(四) 细胞同步化方法
(五) MTT检测
(六) BrdU掺入检测
(七) 免疫组织化学检测
(八) FACS检测SSEA-1表达
(九) RT-PCR检测oct-4表达
(十) 数据分析
三、实验结果
(一) 同步化处理对细胞周期的影响
(二) 同步化处理对ESC增殖活性的影响
(三) 同步化处理后重入细胞周期的变化
(五) 血清饥饿同步化处理对EBs结构的影响
(六) 血清饥饿同步化处理对神经分化的影响
四、讨论
第四章 bFGF触发ESC分化神经元的GLU释放研究
一、前言
二、材料与方法
(一) 试剂与材料
(二) ESC诱导神经元细胞分化培养
(三) 海马神经元细胞离体培养
(四) bFGF的刺激处理
(五) HPLC检测
(六) 胞内自由钙离子检测
三、实验结果
(一) bFGF刺激不同阶段分化神经元后的GIu释放
(二) bFGF刺激分化的神经元及海马神经元胞内[Ca~(2+)]变化
(三) MK801拮抗bFGF刺激分化神经元胞内[Ca~(2+)]变化
四、讨论
第五章 Aβ引起ESC分化的神经元细胞NFKB通路的活化
一、前言
二、材料与方法
(一) 试剂与材料
(二) ESC的神经分化培养
(三) Aβ_(1-42)团聚化处理
(四) 免疫细胞化学检测
(五) MTT分析
(六) 细胞核提取物制备
(七) 凝胶阻滞电泳分析(EMSA)
(八) 免疫印迹分析
二、试验结果
(一) Aβ_(1-42)多肽刺激NFkB在诱导的神经元细胞中活化
(二) p65／p50参与Aβ_(1-42)刺激引起NFkB的活化
(三) Aβ_(1-42)刺激的NFkB活化具有分化时期的依赖性
(四)Aβ_(1-42)处理降低分化神经元细胞的存活率
四、讨论
总结与展望
一、研究工作的总结
二、本研究主要的创新点
三、研究工作展望
参考文献
致谢
发布时间: 2005-07-15
参考文献
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