多能干细胞中稳定表达转录因子FoxA2的细胞特性研究

论文摘要

转录因子FoxA2是胚胎发育过程中神经产生的重要调节因子。研究发现维甲酸诱导的P19多能性干细胞定向神经分化过程中出现FoxA2的表达。为了进一步探讨FoxA2在干细胞向神经分化过程中的作用,我们建立了可以稳定表达GFP-FoxA2融合蛋白的P19细胞株-P19-GFP-rFoxA2细胞株。GFP-FoxA2融合蛋白的稳定表达导致P19-GFP-rFoxA2细胞中多能性相关基因Nanog和Sox2的表达降低和碱性磷酸酶的活性降低,但不影响多能性基因Oct4的表达;同时,该细胞中神经干细胞标志物Nestin的表达以及Prominin-1阳性细胞数目的增多,说明FoxA2的稳定表达促使P19细胞部分丧失干细胞特征并导致神经干细胞特性的出现。另外,P19-GFP-rFoxA2细胞中出现神经细胞分化相关基因NeuroD1的表达。我们证实了FoxA2可以结合NeuroD1的启动子调节其活性,说明NeuroD1是FoxA2的下游靶基因。进一步研究发现:RA诱导P19-GFP-rFoxA2细胞神经分化过程中NeuroD1的表达量升高;P19-GFP-rFoxA2细胞在没有RA悬浮培养的过程中同样发现NeuroD1的表达升高,表明FoxA2可以通过调节NeuroD1促进多能性细胞向神经方向分化。我们的结果表明P19-GFP-FoxA2 cell具有了部分神经细胞特性,FoxA2在促进P19多能性干细胞神经分化过程中发挥着重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写
• 第1章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 干细胞简介
• 1.3 干细胞与神经发生
• 1.4 神经过程中的基因表达调控
• 1.5 FoxA2 转录因子简介
• 1.6 本文构思
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 研究方法及技术
• 第2章 构建稳定表达GFP-rFoxA2 融合蛋白的P19-GFP-rFoxA2 细胞株
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 rFoxA2 引物设计及合成
• 2.3.2 rFoxA2 基因的扩增及纯化
• 2.3.3 重组质粒的构建
• 2.3.4 脂质体转染
• 2.3.5 P19-GFP-rFoxA2 细胞株的筛选
• 2.3.6 P19-GFP-rFoxA2 细胞株的鉴定
• 2.3.7 双荧光素酶报告基因实验
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 rFoxA2 基因的扩增
• 2.4.2 目的基因和载体质粒的酶切和连接
• 2.4.3 质粒转化和筛选
• 2.4.4 脂质体转染实验
• 2.4.5 P19-GFP-rFoxA2 细胞的筛选
• 2.4.6 P19-GFP-rFoxA2 细胞的鉴定
• 2.4.7 共转染以及实验结果
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 第3章 P19-GFP-rFoxA2 细胞株具有神经特性
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 细胞培养
• 3.3.2 碱性磷酸酶活性检测
• 3.3.3 小鼠饲养管理
• 3.3.4 动物解剖实验
• 3.3.5 组织切片实验
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 P19-GFP-rFoxA2 细胞中部分多能性丧失
• 3.4.2 P19-GFP-rFoxA2 细胞中Prominin-1 阳性细胞数增多
• 3.4.3 P19-GFP-rFoxA2 细胞具有部分神经干细胞特性
• 3.4.4 动物模型实验
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 第4章 FoxA2 调节NeuroD1 转录的研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 RA 诱导P19 细胞实验方法
• 4.3.2 RT-PCR 实验
• 4.3.3 克隆NeuroD1 的启动子
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 FoxA2 与NeuroD1 的关联性
• 4.4.2 FoxA2 能调节NeuroD1 的启动子
• 4.5 讨论
• 4.6 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士学位期间发表的论文目录
• 附录B 常用缓冲液和试剂配方
• 致谢