对小菜蛾高毒力Bt菌株的分离、鉴定及菌剂研发

论文摘要

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂,在世界范围内得到广泛的应用。同时其编码Bt杀虫毒蛋白基因也作为主要的杀虫基因转入到多种作物中,在害虫防治中成效显著。室内汰选实验表明大多害虫都具备对Bt制剂及毒蛋白产生抗性的潜能,随着Bt制剂和转Bt基因作物的广泛种植,使得害虫长期处于Bt毒素的选择压力下,目前在田间已经发现对Bt产生抗性的小菜蛾（Plutella xylostella）种群。为得到对抗Bt小菜蛾具有毒杀活性的Bt菌株,明确小菜蛾对Bt产生抗性的机制。本文设计对小菜蛾进行室内抗Bt汰选并进行相关研究,借助敏感和抗性小菜蛾进行高活性Bt菌株的分离筛选,同时对分离菌株的生物学特性、cry基因种类及菌剂的制作开展研究。结果如下：（1）2009-2010连续两年,对黑龙江地区小菜蛾种群消长动态进行了调查,并对11种杀虫剂的毒力进行了比较分析。结果表明：受日最低气温的影响,2010年田间小菜蛾比2009年晚出现十天,但总体趋势一致,均从5月初田间始见小菜蛾成虫,6、7月份出现高峰,到8月末便逐渐消失。杀虫剂对小菜蛾幼虫的杀毒力测定结果表明：氟虫腈对小菜蛾幼虫的毒力最高,其LC50为0.58mg/L; Bt粉剂的毒杀活性良好,虽然略有抗性,但抗性水平极低；另外,小菜蛾对Bt粉剂的耐药性最差,对Bt粉剂最不容易产生抗药性。（2）在室内分别利用Bt粉剂和Cry1Ac毒蛋白汰选小菜蛾,最后得到两个Bt及毒素的高抗种群,其中上海抗性种群（SH-R）对Bt粉剂的抗性达到844.9倍,而深圳抗性（SZ-R）种群对Cry1Ac毒蛋白的抗性高于1500倍。（3）利用AFLP技术对小菜蛾抗性与敏感种群对Bt毒素抗药性差异进行研究。从65对AFLP引物组合中筛选到12对在抗敏小菜蛾间表现多态性的引物组合,共扩增出35条特异表达条带。从12对AFLP多态性引物组合中找到了一个与小菜蛾Bt抗性相关基因相连锁的标记（Eaaa/Mcta-776bp）。用煮沸法回收AFLP勺标记片段,并进行了测序。根据测序结果设计一对特异性引物,将此AFLP标记转化为一个共显性SCAR标记。利用获得的SCAR标记对Bt抗性与敏感小菜蛾种群进行了验证,表明该标记可以可用于小菜蛾对Bt抗性的早期检测。（4）从田间采集死亡小菜蛾幼虫,从中分离出10株苏云金芽孢杆菌。利用抗性和敏感小菜蛾幼虫室内生测表明：各菌株对敏感小菜蛾幼虫的死亡率均在85%以上,其中DBW902毒力最强,48h的LC5o为13.99mg/L；其中9株菌株对抗性小菜蛾具有毒杀活性,其中DBW903对小菜蛾上海抗性种群（SH-R）的毒力最高,其LC5o为43.85mg/L; DBW93对小菜蛾深圳抗性种群（SZ-R）的毒力最高,其LC5o为49.33mg/L。菌株生理生化检测与分析表明,菌株DBW904、DBW93、DBW962与已报道的苏云金芽孢杆菌山东亚种B. thuringiensis subsp.shandongiensis的生理生化特性一致。（5）本研究设计的cry1基因片段引物对筛选Bt菌进行鉴定,经测序分析发现10株菌株均含有cry1基因片段；设计的cry1Ac基因全长引物,得到8个菌的cry1基因全长,经测序比对发现各菌株之间无差别,与cry1Ac基因100%同源；设计的cry2基因引物,得到8个菌的cry2基因全长,经测序比对发现菌株中含有两类cry2基因,分别是cry2Aa和cry2Ab基因。（6）分离的对抗、敏小菜蛾均具有毒杀活性的所有菌株中,Bt.DBW902尤为突出。对Bt.DBW902进行一系列摇瓶发酵发现,在最佳摇瓶培养条件（种子液菌龄10h,接种量2%,初始pH值6.5-7.5,摇床转速200r/min,发酵温度30℃）下发酵48h,活菌数和活芽孢数分别可达到2.99x109CFU/ml和8.88×108CFU/ml,晶体蛋白含量为20.0mg/ml。（7）利用菌株Bt.DBW902制备出了一系列含不同浓度梯度矿物填料的Bt粉剂初型。对其进行芽孢数及活性测定发现人造沸石对Bt粉剂保护作用最佳,1.0%-3.0%的添加比例最有利于菌株Bt.DBW902对小菜蛾毒杀活性的发挥。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 苏云金芽孢杆菌概述
• 1.1.1 苏云金芽孢杆菌的分类
• 1.1.2 苏云金芽孢杆菌cry/cyt基因及晶体毒蛋白的分类
• 1.1.3 苏云金芽孢杆菌的分离研究进展
• 1.1.4 苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白的作用机理
• 1.2 利用苏云金芽孢杆菌防治小菜蛾
• 1.2.1 小菜蛾概述
• 1.2.2 杀小菜蛾苏云金芽孢杆菌及其晶体蛋白
• 1.2.3 小菜蛾对苏云金芽孢杆菌的抗性现状
• 1.2.4 小菜蛾抗药性的研究及监测技术
• 1.3 苏云金芽孢杆菌菌剂研究进展
• 1.3.1 苏云金芽孢杆菌制剂杀虫及增效活性成分
• 1.3.2 苏云金杆菌发酵研究
• 1.3.3 苏云金芽孢杆菌杀虫剂的剂型
• 1.4 本研究的目的意义及内容
• 1.4.1 研究目的意义
• 1.4.2 技术路线
• 第2章 黑龙江地区小菜种群动态调查及抗性监测
• 2.1 材料与试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 小菜蛾种群动态监测
• 2.2.2 抗药性监测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 田间小菜蛾成虫发生规律
• 2.3.2 田间小菜蛾卵、幼虫和蛹发生规律
• 2.3.3 小菜蛾对杀虫剂的抗性监测
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第3章 抗Bt及Cry1Ac毒素小菜蛾饲养与汰选
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 小菜蛾种群
• 3.1.2 汰选药剂
• 3.2 操作方法
• 3.2.1 晶体蛋白提取
• 3.2.2 电泳定量
• 3.2.3 甘蓝苗小菜蛾饲养
• 3.2.4 抗性小菜蛾选育
• 3.2.5 室内生物活性测定
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 晶体蛋白提取
• 3.3.2 Cry1Ac毒蛋白对小菜蛾毒力的生物测定结果
• 3.3.3 成虫的饲养
• 3.3.4 抗Bt制剂小菜蛾的选育
• 3.3.5 抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾的选育
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第4章 小菜蛾Bt抗性检测引物的获得与验证
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 小菜蛾种群
• 4.1.2 主要试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 单头小菜蛾基因组DNA的提取
• 4.2.2 AFLP分子标记体系的建立
• 4.2.3 聚丙烯酰胺凝胶检测
• 4.2.4 获得的AFLP标记向SCAR标记的转换
• 4.2.5 SCAR引物用于检测小菜蛾抗Bt特性
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 DNA的浓度与纯度
• 4.3.2 AFLP选择性扩增的结果
• 4.3.3 抗性标记的获得
• 4.3.4 AFLP标记向SCAR标记的转换
• 4.3.5 SCAR标记小菜蛾抗敏种群间的验证
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第5章 苏云金芽孢杆菌的分离与特性研究
• 5.1 材料与试剂
• 5.1.1 供试小菜蛾
• 5.1.2 样品采集
• 5.1.3 染色试剂
• 5.1.4 仪器设备
• 5.2 研究方法
• 5.2.1 样品前处理
• 5.2.3 菌株的分离
• 5.2.4 菌株毒力测定
• 5.2.5 菌株的鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 菌株的分离与初筛
• 5.3.2 菌株的鉴定结果
• 5.3.3 cry/cyt基因型检测
• 5.3.4 敏感小菜蛾毒力测定结果
• 5.3.5 抗性小菜蛾毒力测定结果
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第6章 cry基因序列克隆与分析
• 6.1 材料与试剂
• 6.1.1 供试菌株
• 6.1.2 引物序列
• 6.2 方法操作
• 6.2.1 模板制备
• 6.2.2 反应体系和扩增程序
• 6.2.3 PCR产物胶回收
• 6.2.4 连接反应
• 6.2.5 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备
• 6.2.6 转化及阳性克隆子的筛选
• 6.2.7 序列测定及分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 cry1基因片段的PCR扩增
• 6.3.2 cry1基因片段的序列测定与分析
• 6.3.3 cry1基因全长的PCR扩增
• 6.3.4 cry1基因全长的序列测定与分析
• 6.3.5 cry2基因全长的PCR扩增
• 6.3.6 cry2基因全长的序列测定与分析
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第7章 苏云金芽孢杆菌菌剂研究
• 7.1 材料与试剂
• 7.1.1 供试菌株
• 7.1.2 培养基
• 7.1.3 蛋白质电泳试剂
• 7.1.4 矿物辅料
• 7.2 操作方法
• 7.2.1 发酵方法
• 7.2.2 影响发酵条件的因素研究
• 7.2.3 菌剂制作方法
• 7.2.4 芽孢数测定
• 7.2.5 菌剂特性测定
• 7.2.6 生物效价测定
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 影响发酵条件的因素
• 7.3.2 菌剂的制作与测试
• 7.4 讨论
• 7.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文