棉花多酚氧化酶基因及其启动子序列的克隆与分析

论文摘要

转Bt棉大面积的种植,使得棉田害虫的地位发生了变化,棉盲蝽、棉蚜、叶蝉等次要害虫的增加,对我国棉花生产安全构成新的威胁。在植物的自身防御机制中,植物的次生代谢物质对害虫化学防御产生重要作用,本文以中棉所49为试验材料,应用分子生物学、生物信息学等技术方法,克隆了棉花诱导防御基因多酚氧化酶基因及其启动子并进行了功能初探,为研究该种多酚氧化酶在棉花防御体系中的具体作用打下基础,本研究取得以下重要成果：1、本研究通过race （?）技术和电子克隆,从中棉49中克隆得到一个棉花PPO基因全长cDNA J序列,命名为GhPPO （GonBank登录号：JQ345705）。通过NCBI在线OKF Finder结合Blastx比对,推测该基因编码区（open reading frame, ORF）为1797bp,可编码598个氨基酸,预测其等电点为6.11,蛋白分子量约67.18kD。该基因5’UTR含102bp,3’UTR含123bp。通过原核表达获得PPO前体蛋白,约67kD的,与预测分子量一致。2、以中棉49的基因组DNA为模板,设计引物得到的多酚氧化酶基因序列与cDNA（?）序列完全一致,即该棉花PPO基因与其他报道的双子叶植物PPO基因一样没有内含子。应用ANTHEPRO5.0（?）软件分析了GhPPO编码区氨基酸序列所含的功能位点。应用ChloroP1.1Server推测该棉花PPO序列含有的N-端导肽（chloroplast transit peptides）,同时应用wolf pSORT进行亚细胞定位,GhPPO表达蛋白主要存在于叶绿体中,推测棉花PPO与细胞光合代谢有关,但是具体的亚细胞细胞定位还需荧光显微检测,且具体的作用机制还有待于进一步研究。3.已经有多种植物的PPO基因启动子被克隆出来,但是棉花多酚氧化酶的启动子的克隆尚未见报道。本文采用染色体步移的方法克隆了棉花PPO基因的启动子序列,命名为GhPPO-P,用PlantCARE和PLACE软件对GhPPO-P的分子结构进行分析,预测的顺式作用元件有根瘤特殊表达序列,光效应启动子（GT-1位点、I-BOX等）,热效应启动子（CAAT盒、AT-rich （?）（?）性元件系列）,冷效应启动子（CCGAC modif、G-BOX （?）结构等）,水分效应启动子（ARE、GC rich、GT rich等）,植物保卫机制相关元件（W-BOX, WUN-motif等）。4.成功构建了棉花多酚氧化酶基因的植物表达载体,为下一步将其转化到拟南芥中进行功能验证打下基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 研究背景与意义
• 1.2 多酚氧化酶的研究现状
• 1.3 启动子的研究
• 第二章 棉花多酚氧化酶基因的克隆
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要的试剂盒、试剂和工具酶
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 RNA的提取
• 2.2.2 RT-PCR得到第一链cDNA
• 2.2.3 GhPPO基因cDNA全长序列的获得
• 2.2.4 DNA片段的凝胶回收
• 2.2.5 高效感受态细胞的制备
• 2.2.6 热激法转化大肠杆菌及阳性克隆的筛选
• 2.2.7 挑斑
• 2.2.8 小量质粒DNA的提取
• 2.2.9 序列测定
• 2.2.10 序列分析
• 2.2.11 电子克隆获得棉花多酚氧化酶cDNA全长
• 2.2.12 棉花基因组DNA的提取
• 2.2.13 以基因组DNA为模板,获取棉花PPO基因全长
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 RNA的提取
• 2.3.2 DNA的提取
• 2.3.3 GhPPO基因的克隆及生物信息学分析
• 2.4 讨论
• 第三章 棉花PPO蛋白的原核表达
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 棉花PPO基因原核表达载体的构建
• 3.2.2 引物设计
• 3.2.3 获得含BamH I酶切位点的棉花PPO片段
• 3.2.4 载体线性化
• 3.2.5 建立In-Fusion克隆反应
• 3.2.6 转化工程菌BL21
• 3.2.7 棉花PPO蛋白的表达
• 3.3 结果与分析
• 第四章 植物表达载体的构建
• 4.1 村料
• 4.2 方法
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.2 获得含Sma /酶切位点的棉花PPO片段
• 4.2.3 载体线性化
• 4.2.4 建立In-Fusion克隆反应
• 4.2.5 转化工程菌感受态农杆菌LBA4404
• 4.3 结果与分析
• 第五章 棉花PPO基因启动子的克隆与功能分析
• 5.1 村料
• 5.2 方法
• 5.2.1 基因组DNA的提取
• 5.2.2 棉花PPO基因启动子的克隆
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 基因组DNA的提取
• 5.3.2 酶切基因组DNA
• 5.3.3 第一次PCR
• 5.3.4 第二次PCR
• 5.3.5 序列分析
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 致谢