产石杉碱甲蛇足石杉内生菌的筛选和鉴定

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）,又称老年痴呆症,是目前影响老年患者生活质量的重要疾病,乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChE）是预防及治疗该病的有效药剂。石杉碱甲（huperzine A, Hup A）是一种分离自我国药用植物蛇足石杉的天然生物碱,具有高效、特异、可逆的乙酰胆碱酯酶抑制活性,用于治疗AD,毒副作用小,持续周期长,不易产生耐受性。Hup A药品来源目前有两个途径：天然植物提取和人工合成。前者受蛇足石杉野生资源的特殊生境限制和过渡采挖,天然贮量已经越来越少,人工栽培尚未成功。后者则因合成步骤繁琐、成本高、活性低,应用受限。据报道,蛇足石杉有极为丰富的内生菌资源,内生菌长期处蛇足石杉植株体内的特殊生境,协同进化,使其也具有了产Hup A的能力,目前有报道已发现蛇足石杉内生菌具有一定的产Hup A能力,因此,利用产石杉碱甲的蛇足石杉内生菌生产Hup A,使其成为Hup A的新型药源,已引起世界医学尤其是中医药领域的极大关注。本论文对蛇足石杉丰富的内生真菌进行分离,筛选产石杉碱甲的蛇足石杉内生菌,为真菌来源的石杉碱甲药品开发做基础理论研究。取蛇足石杉相关组织表面进行彻底的消毒灭菌处理后,于人工培养基培养,对从植株组织内部生长出来的内生菌分离、纯化,再经过扩大发酵后,收集菌丝体,采用酸水法,运用高速逆流色谱仪（HSCCC）对其所含生物碱进行制备性提取,以标准品Hup A作对照,使用高效液相（HPLC）检测菌株的生物碱,对总生物碱提取物用薄板层析（TLC）,液质联用色谱（LC-MS）等分析手段进行分析检测,从分子极性、分子量、官能团等多角度鉴定其化合物；对确定产Hup A的蛇足石杉内生菌ES026A进行形态学和分子生物学鉴定,确定其分类地位。具体结果如下：1从蛇足石杉不同组织分离获得64株内生真菌。以采自湖北恩施佛宝山的野生蛇足石杉为材料,分别取不同组织部位,经彻底地表面消毒,采用微生物常规分离纯化方法,获得了64株内生真菌。叶片和茎部的分别占41%和53%,其它占5%。记录整理其形态学特征、分类编号保藏于-70℃冰箱。2筛选到1株产Hup A的蛇足石杉内生真菌ES026A。取分离获得的48株蛇足石杉内生真菌扩大发酵,收集菌丝体,采用酸水法,以高速逆流色谱仪（HSCCC）提取制备生物碱,运用高效液相进行Hup A的定性定量检测,与标准品Hup A的色谱图比较发现,与标准品Hup A具有相同的特征峰保留时间,经LC-MS检测证明,含有与标准品Hup A相同的一级、二级色谱图物质。经TLC检测,同一条件下与标准品Hup A具有相同的迁移率。3基本明确了蛇足石杉内生真菌ES026A的Hup A产率和其生物活性。经测,ES026A的Hup A产率,按干菌丝测算达1μg/g, ES026A粗生物碱对AChE的IC50为0.23313μg/mL。较标准品Hup A的IC50高约3倍。4 ES026A为胶胞炭疽属胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）结合ES026A菌株的产孢方式、菌丝形态显微观察,菌株DNA的ITS序列扩增、测序、NCBI比对,ES026A为胶胞炭疽属胶孢炭疽菌。该序列提交到GENEBANK并获得序列号HQ876466.1。经查已有报道,本菌株为首次发现具产Hup A的能力。5发现1株产Hup A同系物的蛇足石杉内生真菌ES052BA蛇足石杉内生菌ES052BA的生物碱经LC-MS检测显示,与标准品Hup A一级质谱图不同,但具有相同的二级质谱,说明该生物碱与标准品Hup A具有相同的母核,推知应属Hup A的同系物或衍生物。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 阿尔海默茨病
• 1.1.2 阿尔海默茨病的治疗与石杉碱甲
• 1.1.3 石杉碱甲与蛇足石杉
• 1.1.4 蛇足石杉内生菌与石杉碱甲
• 1.1.5 石杉碱甲的AChE抑制活性研究
• 1.1.6 内生真菌的形态学及分子生物学鉴定
• 1.2 研究目的
• 2 产石杉碱甲的蛇足石杉内生菌初筛
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试植物材料
• 2.1.2 仪器与试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 蛇足石杉资源抚育基地
• 2.2.2 植物材料的灭菌
• 2.2.3 内生菌的分离纯化及保藏
• 2.2.4 蛇足石杉内生菌的液体扩大发酵及生物碱提取
• 2.2.5 生物碱的HPLC检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 蛇足石杉植物的鉴定
• 2.3.2 蛇足石杉内生真菌的分离纯化
• 2.3.3 蛇足石杉内生真菌中石杉碱甲含量测定
• 2.3.4 产石杉碱甲的蛇足石杉内生菌的筛选
• 2.3.5 其它蛇足石杉内生菌的发酵产生物碱的筛选
• 2.3.6 讨论
• 3 蛇足石杉内生菌所产石杉碱甲的鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 仪器与试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.2 方法
• 3.2.1 蛇足石杉内生真菌中石杉碱甲的提取方法
• 3.2.2 蛇足石杉内生真菌中石杉碱甲含量的测定
• 3.2.3 蛇足石杉内生真菌生物碱的纯化
• 3.2.4 蛇足石杉内生菌生物碱的LC-MS检测
• 3.2.5 蛇足石杉内生菌生物碱的TLC检测
• 3.2.6 总生物碱的AChE活性抑制试验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 产石杉碱甲的蛇足石杉内生菌生物碱提纯
• 3.3.2 蛇足石杉内生真菌ES026A、ES052BA生物碱的LC-MS检测
• 3.3.2.1 蛇足石杉内生真菌ES026A生物碱的LC-MS检测
• 3.3.2.2 蛇足石杉内生真菌ES052BA生物碱的LC-MS检测
• 3.3.3 蛇足石杉内生真菌ES026A粗生物碱的TLC检测
• 3.3.4 AChE抑制活性
• 3.3.5 讨论
• 4 蛇足石杉内生菌ES026A的鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 仪器与试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 形态学鉴定
• 4.2.2 分子生物学鉴定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 ES026A形态观察
• 4.3.2 分子生物学鉴定
• 4.3.3 讨论
• 5 小结
• 思考
• 参考文献
• 致谢
• 附录