论文摘要
第一部分AML1a在小鼠造血细胞增殖分化异常及恶性转化中的作用细胞的增殖分化受到严格调控,转录因子协调细胞中多种基因的表达是其中重要的调控机制。造血细胞的增殖失控、分化能力的丧失将可能导致细胞的恶性转化及白血病的发生。因此,阐明转录因子的功能对于确定细胞增殖分化调控机制以及在细胞恶性转化中的作用具有重要意义。AML1也称之为PEBP2αB、CBFα2或RUNX1,是一种重要的转录调节因子。它在造血细胞中普遍表达,调节造血细胞的分化和增殖。RUNX1/AML1通过选择性剪接产生至少三种异构体:AML1a、A.ML1b和AML1c。其中,AML1b与AML1c仅在氨基末端存在27个氨基酸残基的差异,均具有两个主要的功能结构域:DNA结合结构域和转录激活结构域,两者的功能基本相同,即我们通常所说的AML1。AML1a具有DNA结合结构域,但缺少转录激活结构域,因此通常被认为不具有转录激活功能,但由于其具有DNA结合结构域,可以与AML1b/1c竞争结合靶基因的DNA结合位点,导致靶基因不能正常转录,提示AML1a可能干扰AML1的转录调节功能。有证据表明,AML1a在急性髓系白血病（AML）中表达高于正常对照。我们的前期实验也已证实AML1a在急性白血病（AL）中的高表达,而且,AML1a可以抑制由AML1b介导的M-CSF受体（M-CSFR）启动子的转录,提示AML1a对AML1b具有拮抗作用。有学者认为转录激活区的缺失可能引起白血病的发生,但目前尚无此方面的报道。为了进一步研究AML1a在造血及白血病发病中的作用并探讨其作用机制,本文完成了下列研究工作:1.AML1a表达载体的构建及病毒的制备pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP质粒,将此质粒和pMSCV-IRES-YFP分别与辅助质粒pV Pack-Eco（含Env）、pV Pack-GP（含gal-pol）组合,通过磷酸钙沉淀法转染293T细胞,制备逆转录病毒。病毒感染3T3细胞,检测病毒滴度,并测定AML1a的表达情况。结果显示在感染的细胞中证实有AML1a和YFP的表达,所制备的病毒滴度满足后续实验的要求。2.AML1a在小鼠造血细胞增殖分化异常及恶性转化中的作用1) C57雄性小鼠的骨髓单个核细胞（BMMNC）通过逆转录病毒转导AML1a及空白对照后,置于含mSCF、mIL-3、mIL-6的IMDM培养液中进行培养,分别于感染后11天、23天和35天通过流式细胞仪检测确定各系表面标志的变化,结果显示感染AML1a的BMMNC中Sca-1及Thy1.2的表达均较对照组升高,提示AML1a可能将造血干细胞的分化阻滞于较为早期的淋巴细胞阶段。2)将转导AML1a的C57小鼠的骨髓单个核细胞,尾静脉注射至致死剂量照射的C57雌性小鼠体内,单一转导YFP的小鼠作为对照。定期尾静脉取血,查血象及白细胞分类。血象有异常改变后,处死小鼠,观察有无肝、脾、淋巴结肿大,流式细胞术分析细胞表型变化。转导AML1a的12只C57小鼠中,有9只在移植后3-11个月相继死亡,解剖可见肝脾肿大,可伴有胸腺瘤和淋巴结肿大。病理可见骨髓、脾、肺、肾、胸腺或淋巴结可见大量白血病细胞浸润。流式分析显示白血病细胞主要有两个表型:Sca-1+cCD3+和CD3+CD4+CD8+,提示均为T-淋巴细胞白血病。发病小鼠脾细胞接种同类小鼠可再次发生表型相同的T-淋巴细胞白血病。以上结果表明AML1a在白血病的发生中发挥重要的作用,并且可能具备导致白血病的能力。3)将AML1a发病小鼠脾细胞传代后取第二代发病鼠的骨髓细胞进行细胞周期测定。与对照组相比,发病小鼠骨髓中G0/G1细胞比例增高,S期细胞比例明显降低,提示AML1a将小鼠骨髓细胞阻滞于G0/G1期。此结果说明AML1a基因可能通过抑制细胞自G0/G1期向S期的转换,改变正常细胞增殖分裂的进程,导致造血细胞的恶性转化。综上所述,本研究通过逆转录病毒转导AML1a至小鼠BMMNC中,并将其移植到致死剂量照射的小鼠体内,首次证实了AML1a的可以引起造血细胞恶性转化并导致白血病发生。初步推测AML1a可能在白血病特别是淋巴细胞白血病的发病中起重要作用。此外,我们的实验也为白血病的治疗提供了新的治疗靶点和动物模型。第二部分全反式维甲酸处理NB4细胞的微小RNA表达谱分析微小RNA（microRNA,miRNA）是一种非编码小分子RNA,可以作为基因的负调控因子调节多种生物进程。每一种微小RNA可以调控数百种靶基因。近来研究显示微小RNA的突变或者异常表达与人类许多肿瘤发生相关,它能够作为肿瘤抑制物或者癌基因发挥作用,因此可能有助于肿瘤的诊断和治疗。我们通过确定全反式维甲酸（ATRA）诱导急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞系NB4细胞分化过程中微小RNA表达谱的变化,寻找可能对白血病细胞分化起作用的微小RNA。细胞形态学和流式细胞术验证ATRA处理NB4细胞的分化。利用微小RNA芯片技术,检测和分析NB4经ATRA处理不同时间点的微小RNA表达谱差异,实时定量RT-PCR技术验证微小RNA表达的变化,并对微小RNA进行靶基因预测。ATRA处理后的NB4细胞在形态上出现向粒细胞的分化,分析CD11b等髓系表面抗原的表达,ATRA处理0h及72h时CD11b的表达分别为3%和96%,进一步证实了NB4细胞的分化。基因芯片检测从576个候选的人类微小RNA中,筛选出24个差异表达微小RNA（表达上调的有21个,表达下调的有3个）,其中,有16个微小RNA可以进行靶基因预测。这些miRNA的靶基因多涉及与白血病发生有关的同源盒基因家族成员。实时定量RT-PCR验证了2个显著上调微小RNA（miR-210和miR-342）表达的变化,两种微小RNA标准化后的比值分别为2.16和4.61。差异表达微小RNA可能与NB4的分化相关,同时也可能是转录后水平抑制基因表达调控方式的基础。
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相关论文文献
- [1].AML1a在小鼠造血细胞增殖分化异常中的作用[J]. 中国实验血液学杂志 2011(06)
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