水稻AP2/EREBP型转录因子的克隆与功能的初步研究

论文摘要

植物在其生长与发育过程中,不可避免的要受到各种不利环境因素的干扰,包括生物的与非生物的胁迫环境。这些胁迫环境严重影响植物的生长发育及作物的产量。同时,植物在与胁迫环境的相互作用过程中,也演化出了一套适应和应答各种逆境的机制和策略。许多研究表明,植物AP2/EREBP类转录因子对于植物应答外界胁迫及提高植物的抗逆性方面起着极为重要的作用。因此研究AP2类转录因子的作用机制具有重要的理论与实践意义。本研究主要结果如下:1.目的基因的克隆:从构建的SSH（suppression subtractive hybridization）抑制差减杂交cDNA文库中,利用RACE-PCR技术克隆出了一个水稻AP2类转录因子—OsAP2LP基因（文库由武汉大学生命科学院赵洁教授课题组构建）。根据其预测的氨基酸序列分析表明,它含有一个高度保守的AP2-DNA结合域,与其他己公布的AP2家族成员具有较高的同源性。系统进化树分析表明,OsAP2LP与典型的AP2亚家族成员在进化树上的距离较近。表明OsAP2LP基因可能为水稻AP2/EREBP家族的新成员。2.目的基因的表达特性分析:用外源植物激素与非生物胁迫处理一周水稻幼苗,半定量RT-PCR分析结果显示OsAP2LP应答于脱落酸ABA,水杨酸SA及细胞分裂素（玉米素ZT）,在经处理后,其转录水平升高;而对于赤霉素GA和茉莉酸JA处理,其在mRNA水平无明显的变化;在高盐和干旱胁迫处理中,该基因的转录子迅速积累,并维持在较高水平;而对于冷处理,则无显著的差异。组织特异性表达分析表明OsAP2LP基因,主要优势表达于根、茎、30天胚胎,一周的幼苗中,而在叶,15天胚胎,花穗,干种子中的表达水平较低。3.启动子区域序列分析（生物信息学）:分析结果显示OsAP2LP基因启动子区域含有ABA应答元件-ACGT,和参与细胞分裂素信号途径ARR1蛋白的应答核心元件-NGATT。同时还含有MYB和MYC转录因子的识别位点,其核心序列分别为:5’-YAACGG-3’,5’-CANNTG-3’;此外还含有干旱/低温应答元件,核心序列为5’-ACCGAC-3’/5’-CCGAC-3’,以及GCC-box核心元件5’-GCCGCC-3’。4.T-DNA插入突变分析表明,T-DNA片段的插入阻断了OsAP2LP全长编码区的正常转录,其中采用三引物法没能扩增出大片段（也即mRNA水平鉴定时,只检测到T-DNA插入序列前的片段而不能检测到整个OsAP2LP cDNA片段）的株系在萌发后一周至一个月内陆续枯死,表明了OsAP2LP在水稻中发挥着非冗余的功能,其功能的丧失,可能导致下游的基因不能有效的被转录而致植株死亡的表型。5.另外,本研究还对文库中筛选的另一个AP2/ERF类转录因子基因—OsTSH1进行了转基因研究。本研究中主要通过将该OsTSH1基因在拟南芥中异源过量表达,检测了其对下游可能的靶基因的表达调控作用。研究结果显示,过量表达OsTSH1基因能有效的转录激活拟南芥中有代表性的胁迫应答基因如生物胁迫应答基因PR1,PDF1.2及典型的非生物胁迫应答基因RD29A等的表达水平较在野生型中,均有显著的提高。由此说明OsTSH1基因在拟南芥中,功能上是相关的。作为转录因子,能有效的激活下游可能的胁迫应答基因。通过以上实验表明OsAP2LP基因具有AP2/EREBP类转录因子的基本特性。表达特性分析证明OsAP2LP基因受干早、高盐等非生物胁迫诱导表达,其还可能参与根的形成以及晚期胚胎发育等生物学事件。这些研究结果对于将来利用这类转录因子来改良水稻抵抗生物和非生物胁迫的能力提供了重要的理论基础,同时具有重要的实际应用意义。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写词及英汉对照
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 植物对非生物胁迫的响应
• 1.3 植物对非生物胁迫应答的信号传导途径
• 1.4 抗逆相关转录因子的研究现状
• 1.4.1 AP2/EREBP类转录因子
• 1.4.2 bZIP类转录因子
• 1.4.3 MYB/MYC转录因子
• 1.4.4 WRKY转录因子
• 1.5 植物中AP2/EREBP类转录因子的研究进展
• 1.5.1 AP2亚家族
• 1.5.2 EREBP亚家族
• 1.5.3 DREB亚家族
• 1.5.4 DREB类转录因子的结构及其顺式作用元件
• 1.5.5 DREB转录因子在非生物胁迫应答中的作用
• 1.5.6 DREB转录因子的信号传导
• 1.5.7 过表达DREB转录因子的植物抗逆基因工程
• 1.6 植物转录因子的研究方法
• 1.7 本研究的目的与意义
• 第二章 水稻OsAP2LP基因全长的获得与鉴定
• 2.1 引言
• 2.1.1 AP2/EREBP基因简介
• 2.1.2 RACE技术简介
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 水稻总RNA提取
• 2.2.3 总RNA质量检测
• 2.2.3.1 分光光度计检测总RNA的浓度和纯度
• 2.2.3.2 甲醛变性胶电泳检测总RNA的完整性
• 2.2.4 RACE cDNA模板合成
• 2.2.5 RACE-PCR
• 2.2.6 琼脂糖凝胶纯化特异DNA片段
• 2.2.7 目的DNA片段的克隆及鉴定
• 2.2.8 重组质粒转化筛选
• 2.2.9 菌液PCR检测重组质粒
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA的提取和鉴定
• 2.3.2 5'-RACE和3'-RACE扩增
• 2.3.3 特异3'-RACE及5'-RACE PCR产物的克隆及鉴定
• 2.3.4 OsAP2LP基因的序列分析
• 2.3.5 OsAP2LP基因同源性搜索
• 2.4 讨论
• 第三章 水稻OsAP2LP基因的表达模式研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 植物材料与处理方法
• 3.2.2 总RNA的提取与鉴定
• 3.2.3 RT-PCR
• 3.2.3.1 基因组DNA的消化
• 3.2.3.2 反转录合成第一链
• 3.2.3.3 PCR反应
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 RT-PCR检测OsAP2LP基因的表达模式
• 3.3.1.1 OsAP2LP基因的组织特异性表达模式
• 3.3.1.2 植物激素处理对OsAP2LP基因表达水平的影响
• 3.3.1.3 非生物胁迫处理对OsAP2LP基因表达水平的影响
• 3.3.2 OsAP2LP基因启动子核酸序列分析
• 3.4 讨论
• 第四章 OsAP2LP基因T-DNA插入突变体研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 材料种植
• 4.2.2.2 突变体库
• 4.2.2.3 纯合体的鉴定
• 4.2.2.4 突变体表型观察
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 T-DNA插入序列在基因组上侧翼序列的查找
• 4.3.2 基因组上T-DNA序列插入检测结果
• 4.3.3 mRNA水平鉴定T-DNA对OsAP2LP基因表达的影响
• 4.3.4 OsAP2LP基因插入突变体植株呈矮小的表型
• 4.4 讨论
• 第五章 水稻OsTSH1基因的过量表达研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 RNA的提取和RT-PCR
• 5.2.2.2 cDNA克隆与序列测定
• 5.2.2.3 浸花法转化拟南芥
• 5.2.2.4 转基因阳性植株的鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 重组子pCAMBIA1300-OsTSH1的检测
• 5.3.2 转基因拟南芥阳性植株的鉴定
• 5.3.3 OsTSH1有效的转录激活下游可能的胁迫应答靶基因
• 5.4 讨论
• 第六章 总结与展望
• 参考文献
• 附录Ⅰ 实验室常用protocol及溶液配方
• 附录Ⅱ 硕士期间发表或待发表的文章
• 致谢