大豆子叶节再生体系的建立及农杆菌介导的抗菌肽基因的遗传转化

论文摘要

大豆是重要的油料作物和粮食作物,不仅是世界上食用油和植物蛋白的主要来源,而且还是工业原料和牲畜家禽的重要饲料。抗菌肽是一种高效、广谱的活性多肽,对细菌、真菌、病毒及原生生物都有一定的抵抗作用。将抗菌肽基因导入大豆中,为培育优质抗病的大豆种质资源奠定基础。建立高效稳定的大豆再生体系是大豆遗传转化的先决条件。本研究以辽豆17、辽豆18、辽豆23为试验材料,诱导不定芽的发生,分别对不保留子叶和保留半片子叶以及胚尖作为外植体的不定芽诱导率做了比较,建立了快速有效的子叶节再生体系。大豆种子经氯气熏蒸的方法消毒后;接种于萌发培养基中培养5d;将获得的外植体接种于不定芽诱导培养基（1/2MSB +4.0 mg/L 6-BA +0.05mg/L IBA+3%蔗糖+0.7%琼脂）中诱导不定芽的发生;待不定芽长出后转移至不定芽伸长培养基（1/2MSB +0.5 mg/L 6-BA +0.05mg/L IBA +3%蔗糖+0.7%琼脂）中诱导不定芽伸长;待不定芽长至2～3cm时转入不定根诱导培养基（1/2MSB +1.0mg/L IBA +2%蔗糖+0.7%琼脂）中诱导不定根的发生;待根长至3～5cm时移栽到营养土:草炭:蛭石（1:2:2）的基质中培养成成熟的植株。以辽豆17为试验材料,通过农杆菌介导法将抗菌肽基因导入大豆基因组中,经试验得到头孢霉素的最适除菌浓度为300mg/L;卡那霉素的筛选浓度为60 mg/L;并且在诱导不定根的发生时不添加卡那霉素进行二次筛选。经PCR检测和绿色荧光蛋白的检测初步证明了抗菌肽基因已经转入辽豆17植株中,并得到了表达,转化率为10.3%。得到了2株T1代植株,经PCR检测,其中的一株表现为阳性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 0.1 大豆遗传转化的方法
• 0.2 大豆遗传转化的受体系统
• 0.2.1 大豆不定芽发生再生系统
• 0.2.2 大豆体细胞胚胎发生再生系统
• 0.2.3 原生质体再生系统
• 0.3 抗菌肽基因在植物基因工程中的研究与应用
• 0.4 转基因大豆的发展及应用
• 0.5 试验目的及意义
• 第1章 大豆子叶节植株再生体系的建立
• 1.1 主要仪器设备及基本试剂
• 1.1.1 主要仪器设备
• 1.1.2 基本试剂配制
• 1.1.3 基本培养基的组成
• 1.2 试验材料
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 不同培养阶段培养基的配制
• 1.3.2 外植体的获得
• 1.3.3 不定芽的诱导
• 1.3.4 不定芽的伸长
• 1.3.5 不定根的诱导，筛选出最适生根条件
• 1.3.6 移栽
• 1.3.7 培养条件
• 1.4 结果与分析
• 1.4.1 大豆子叶节再生体系的建立
• 1.4.2 大豆子叶节再生体系与胚尖再生体系的比较
• 1.5 讨论
• 1.5.1 不同激素浓度对子叶节再生体系的影响
• 1.5.2 子叶节再生体系中外植体的不同获得方式的比较
• 1.5.3 大豆子叶节再生体系与胚尖再生体系的比较
• 1.6 结论
• 第2章 根癌农杆菌介导的抗菌肽基因的遗传转化
• 2.1 主要仪器设备及基本试剂
• 2.1.1 仪器设备
• 2.1.2 试剂配制方法
• 2.1.3 农杆菌生长培养基
• 2.1.4 子叶节遗传转化培养基的组成
• 2.2 试验材料
• 2.2.1 试验用大豆品种
• 2.2.2 质粒和农杆菌菌株
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 农杆菌的培养
• 2.3.2 pBI-GFP-ABP 质粒DNA 的提取
• 2.3.3 根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞的制备
• 2.3.4 质粒DNA 冻融法转化农杆菌LBA4404 菌株
• 2.3.5 pBI-GFP-ABP 质粒转化农杆菌结果鉴定
• 2.3.6 抑菌性抗生素头孢霉素适宜浓度的确定
• 2.3.7 选择性抗生素卡那霉素对不定芽分化的影响
• 2.3.8 选择性抗生素卡那霉素对不定芽生根的影响
• 2.3.9 农杆菌介导的大豆子叶节再生的遗传转化
• 2.3.10 绿色荧光蛋白标记基因检测
• 2.3.11 大豆转化植株 PCR 分子检测
• 2.3.12 T1 代大豆植株的PCR 检测
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 农杆菌介导的抗菌肽基因的转化过程
• 2.4.2 PBI-GFP-ABP 质粒转化农杆菌结果鉴定
• 2.4.3 抑菌性抗生素头孢霉素适宜浓度的确定
• 2.4.4 卡那霉素对不定芽分化的影响
• 2.4.5 卡那霉素对不定芽生根的影响
• 2.4.6 绿色荧光蛋白表达的情况
• 2.4.7 PCR 扩增鉴定结果
• 2.4.8 农杆菌介导的辽豆17 子叶节的转化率
• 2.4.9 T1 代大豆植株的PCR 检测结果
• 2.5 讨论
• 2.5.1 抗生素对遗传转化的影响
• 2.5.2 农杆菌介导法对大豆遗传转化效率的影响
• 2.6 结论
• 第3章 结论及展望
• 3.1 大豆子叶节再生体系的建立
• 3.2 农杆菌介导的抗菌肽基因的遗传转化
• 3.3 进一步工作方向
• 致谢
• 参考文献
• 缩写符号说明
• 攻读学位期间发表的学术论文