超级细菌蜡状芽孢杆菌抗药靶蛋白金属β-内酰胺酶BcⅡ与抗生素之间的分子识别和相互作用

论文摘要

超级细菌通过其抗药靶蛋白金属p-内酰胺酶催化水解p-内酰胺类抗生素分子的p-内酰胺环而使临床上使用的几乎所有p-内酰胺类抗生素失去效用,然而目前人们对于金属p-内酰胺酶结合p-内酰胺类抗生素过程的分子识别和相互作用却知之甚少。蜡状芽孢杆菌产的金属酶BcⅡ是一种具有代表性的超级细菌抗药靶蛋白金属p-内酰胺酶。本研究将荧光光谱、紫外吸收光谱和圆二色光谱等实验方法和分子对接模拟技术、热力学和动力学模拟等理论预测方法相结合,以金属p-内酰胺酶BcⅡ结合青霉素V（PV）和舒巴坦（Sul）的过程为研究对象,从结合过程中金属酶BcⅡ结构为结合抗生素所引起的适应和变化、金属酶BcⅡ分子内氨基酸残基和抗生素分子官能团的空间分布取向和对接复合物的稳定性,以及它们间的作用位点种类和位点数、作用力的性质和距离等,来探讨金属酶BcⅡ与抗生素之间的分子识别和相互作用。1.金属酶BcⅡ对抗生素PV的酶活性在277K、pH7.0Tris-HCl缓冲液中是298K时的38.1%,反应体系开始出现反应产物的时间约为2mins,说明2mins以内水解过程处于金属酶BcⅡ与PV相互识别、相互影响的结合过程。通过紫外光谱和荧光发射光谱的研究,测得了在277K下抗生素PV和金属酶BcⅡ结合过程的饱和结合比是0.67。测定了277K下金属酶BcⅡ与PV结合体系的圆二色光谱、荧光同步光谱、KI猝灭光谱以及荧光发射光谱的二阶导数光谱来研究结合过程中的金属酶BcⅡ对抗生素PV的分子识别。结果表明,金属酶BcⅡ构象发生了细微的改变,其有序结构α-螺旋结构含量降低（30.4%至28.9%）而无序结构无规则卷曲含量升高（34.2%至36.0%）,且表面发色氨基酸残基局部构像微弱改变,金属酶BcⅡ以此来识别抗生素PV,为进入反应裂解β-内酰胺环的化学反应过程做好准备。在对两者相互作用的研究中测定了277K、281K和285K三个温度下金属酶BcⅡ与抗生素PV结合过程的荧光发射光谱,研究表明金属酶BcⅡ与抗生素PV相互作用形成了引起静态猝灭的金属酶BcⅡ-PV复合物,金属酶BcⅡ与抗生素PV约以1：1进行结合且结合常数为1.15-2.00×106L/mol,由热力学参数焓变AH°=-45.38kJ/mol、熵变ΔS°=-42.80J/mol和吉布斯自由能变为负值推知金属酶BeⅡ与抗生素PV相互作用的主要作用力是氢键和范德华力,且通过金属酶BcⅡ结合抗生素PV的动力学模拟说明了金属酶BcⅡ结合抗生素PV的过程中形成了一个稳定的中间态复合物。运用Forster非辐射能量转移理论测得抗生素PV与金属酶BeⅡ的色氨酸残基的平均作用距离为2.02nm。分子对接模拟显示金属酶BeⅡ与抗生素PV作用的位点和键合机理与实验结果基本一致。2.金属酶BcⅡ对Sul的酶活性在277K、pH7.0Tris-HCl缓冲液中是298K时的25.0%,开始出现反应产物的时间约为2mins。紫外光谱和荧光发射光谱的测定测得了在277K下Sul和金属酶BeⅡ结合过程的饱和结合比是0.53。在277K金属酶BcⅡ与Sul结合2mins的条件下,研究结合体系中分子识别过程,通过测定金属酶BeⅡ和Sul结合过程中引起的金属酶BeⅡ构象变化的圆二色光谱、荧光同步光谱、KI猝灭光谱以及荧光发射光谱的二阶导数光谱,发现在结合过程中金属酶BcⅡ构象发生了细微的改变,有序结构α-螺旋结构含量降低（30.5%至29.0%）和无序结构无规则卷曲含量升高（34.1%至35.9%）且酶的表面发色氨基酸残基局部构像微弱改变,金属酶BeⅡ以此来适应和识别Sul,为进入反应裂解Sul的p-内酰胺环的化学反应过程做好准备。在对两者相互作用的研究中测定了277K、281K和285K三个温度下金属酶BcⅡ与Sul结合过程的荧光发射光谱,金属酶BeⅡ与Sul相互作用形成了引起静态猝灭的金属酶BcⅡ-Sul复合物,并得出金属酶BeⅡ与Sul约以1：1进行结合且结合常数为1.49-3.98×105L/mol,由热力学参数焓变ΔH°=-80.70kJ/mol、熵变ΔS°=-184.17J/mol和吉布斯自由能变为负值推知金属酶BcⅡ与Sul相互作用的主要作用力是氢键和范德华力,且通过金属酶BcⅡ结合Sul的动力学模拟说明了金属酶BcⅡ结合抗生素Sul的过程中形成了一个稳定的中间态复合物。运用Forster非辐射能量转移理论,测得Sul与金属酶BcⅡ的色氨酸残基的平均作用距离为2.14nm。分子对接模拟显示了金属酶BcⅡ与Sul作用的位点和键合机理与实验结果一致。3.对比了金属酶BcⅡ与两种抗生素的分子对接和相互作用的情况,初步推断金属酶BcⅡ结合两种抗生素的过程中都发生了金属酶BcⅡ结构的微弱改变；结合过程中金属酶BcⅡ与两种抗生素之间都形成了稳定的引起荧光静态猝灭的复合物,由两个结合体系的焓变、熵变以及吉布斯自由能变均为负值得出金属酶BcⅡ与两种底物的相互作用主要驱动力都以氢键和范德华力为主,且结合过程都为放热的自发过程；动力学模拟推知两个结合体系的结合过程中都形成了一个稳定的中间态复合物。在结合两种抗生素分子结构和金属酶BcⅡ分子对接模拟的结果比较,推断抗生素PV和Sul在其分子结构方面的差异使得金属酶BcⅡ结合时对底物的亲和力的大小和结合底物的能力等方面表现出差异：两个相互作用体系中形成复合物的金属酶BcⅡ的活性位点相同,但抗生素PV的侧链上的苯环位于金属酶BcⅡ活性“口袋”外侧,而Sul由于空间位阻小则全部位于金属酶BcⅡ活性“口袋”内部；分子对接模拟中金属酶BcⅡ与PV之间有三组氢键（包含一组侧链苯氧基-O上形成的氢键）的相互作用,而金属酶BcⅡ与Sul之间只有两组氢键的相互作用,从而使得抗生素PV与金属酶BcⅡ的亲和力以及形成的金属酶BcⅡ-PV复合物的稳定性都要大于Sul与金属酶BcⅡ的结合体系。BcⅡ-PV结合体系的荧光猝灭常数和结合常数均高于BcⅡ-Sul结合体系的,也佐证了这一推断。运用以上分析手段能够发现不同分子结构的p-内酰胺类抗生素与超级细菌抗药靶蛋白金属β-内酰胺酶BcⅡ在分子识别和相互作用中的异同,进而能够从分子水平上了解金属酶BcⅡ与p-内酰胺类抗生素之间分子识别和相互作用的本质特征,为研究开发新型的能够抗超级细菌的超级抗生素药物提供一种新的视野和一些有价值的信息。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 引言
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 β-内酰胺类抗生素
• 1.1.2 β-内酰胺酶
• 1.1.3 金属β-内酰胺酶和β-内酰胺类抗生素分子的研究进展
• 1.2 研究内容及主要研究方法
• 1.2.1 研究内容
• 1.2.2 主要研究方法及原理
• 1.3 研究意义
• 第二章 金属β-内酰胺酶BcⅡ与青霉素V（PV）结合过程的分子识别和相互作用的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 常温和低温下金属酶BcⅡ对抗生素PV的酶活
• 2.3.2 金属酶BcⅡ分子和抗生素PV在结合过程中饱和分子比
• 2.3.3 金属酶BcⅡ和抗生素PV的分子识别——金属酶BcⅡ构象变化
• 2.3.4 金属酶BcⅡ和抗生素PV的相互作用
• 2.3.5 分子对接
• 2.4 本章小结
• 第三章 金属β-内酰胺酶BcⅡ与舒巴坦（Sul）结合过程的分子识别和相互作用的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 常温和低温下金属酶BcⅡ1对Sul的酶活
• 3.3.2 金属酶BcⅡ分子和Sul在结合过程中饱和分子比
• 3.3.3 金属酶BcⅡ和Sul的分子识别——金属酶BcⅡ构象变化
• 3.3.4 金属酶BcⅡ和Sul的相互作用
• 3.3.5 分子对接
• 3.4 本章小结
• 第四章 金属β-内酰胺酶BcⅡ与抗生素PV和Sul两个结合体系的比较
• 4.1 引言
• 4.2 金属酶BcⅡ对两种抗生素的酶活力的比较
• 4.3 金属酶BcⅡ与两种抗生素在结合过程中饱和分子比
• 4.4 金属酶BcⅡ与两种抗生素的分子识别
• 4.4.1 荧光光谱比较
• 4.4.2 圆二色光谱比较
• 4.5 金属酶BcⅡ与两种抗生素结合过程中分子间的相互作用
• 4.5.1 猝死机制比较
• 4.5.2 作用距离比较
• 4.5.3 结合位点数和结合常数的比较
• 4.5.4 热力学参数和作用力比较
• 4.5.5 动力学活化能比较
• 4.6 分子对接比较
• 4.7 讨论
• 4.7.1 基于分子识别中酶构象变化的讨论
• 4.7.2 基于结合过程中相互作用本质特征的讨论
• 全文总结
• 1. 本论文的主要研究内容和结果
• 2. 进一步研究工作的设想
• 参考文献
• 攻读博士学位期间取得的科研成果
• 个人简介
• 致谢